分泌和摄取用于细胞间通讯的外泌体和其他胞外囊泡的特异性（上）

尽管人们在20世纪60年代后期首次描述了在哺乳动物组织或液体中，有囊泡在细胞周围存在，但是直到2011年才提出通用术语“胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）”来定义所有的由脂质双层包围的胞外结构，如图1所示。

在1980年代，人们描述了EV可以通过质膜向外出芽或通过细胞内内吞运输途径形成，其中这种途径涉及多泡晚期内吞区室---也称为多泡体（multivesicular body, MVB）---与质膜的融合，如图2所述。

这种融合事件导致这些区室中的管腔内囊泡（intraluminal vesicle, ILV）释放到细胞外，从而产生一种称为外泌体（exosome）的EV亚型，而且所产生的外泌体具有与ILV相同的大小（直径<>

图1.不同胞外囊泡（EV）亚型的物理特征。

人们最初认为外泌体分泌是细胞清除不想要的蛋白的一种机制。然而，20世纪90年代后期的研究表明，它可以起到细胞间通讯的作用，特别是在免疫反应和癌症中。

对这一概念的强烈支持出现在2007年，在那年科学家们已证实外泌体含有mRNA和microRNA，而且当被转移到受者细胞（recipient cell）时，所含有的mRNA和microRNA仍然保持功能并改变细胞行为。

与此同时，EV被称为微泡（microvesicle），微粒（microparticle）或核外粒体（ectosome），很可能是从质膜释放出来的，而且也已经证实能够在细胞之间转移功能性的蛋白和RNA。

图2.胞外囊泡（EV）分泌机制。

人们已观察到在各种细胞类型中，大小与外泌体一样或更大的EV是从细胞主体的质膜或膜延伸物（比如微绒毛、丝状伪足，纤毛和鞭毛）出芽而形成的。大小与外泌体相当的EV在大小、密度和膜定位方面具有与外泌体相同的生物物理特征，因此，目前的方法无法有效地将它们区分开来。

细胞释放出的源自MVB的外泌体与其他小型EV的相对比例是高度可变的，取决于细胞类型、环境条件和其他因素（比如感染或人工诱导分子表达），而且通过当前的大多数实验方法制备出的外泌体可能含有内体起源的小型EV（也就是外泌体）和非内体起源的小型EV，以及其他的基于脂质的非囊泡结构（比如多种密度的脂蛋白，即中密度脂蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白）和新鉴定出的外泌颗粒（exomere）。

近期，富含晚期内体组分的外泌体被定义为一种带有四跨膜蛋白CD63（一种在MVB中堆积的蛋白）和CD9/CD81（主要存在于质膜上）的小型EV亚型，不过这种定义还需在其他的细胞中和在其他的条件下进行验证。

在包括癌症、免疫反应、心血管疾病、再生和干细胞疗法在内的许多病理生理情况下，EV发挥着许多功能。

尽管许多研究将这些功能描述为是外泌体特有的，但是人们已发现许多外泌体制备物存在潜在的多种亚细胞起源，这表明多种EV类型具有更广泛的功能相关性。

在一篇新的发表在2019年1月那期Nature Cell Biology期刊上的评论类型文章中，Mathilde Mathieu等人通过一些非详尽的例子讨论了外泌体和源自质膜的EV在生物发生、分泌、将它们的内含物靶向运送到受者细胞中和随后在受者细胞中发挥的功能方面的特异性[1]。

在MVB内部或质膜上的囊泡出芽

内体ILV和源自质膜的EV共有的一个重要特征是与在不同区室之间进行运送所需的其他细胞内出芽事件不同的是，它们都朝着远离细胞质的方向进行出芽。

因此，它们的膜定位与细胞表面的膜定位相同，从而暴露跨膜蛋白的胞外结构域并包围细胞质组分。

鉴于已知的EV生物发生、分泌以及与靶细胞之间相互作用的分子机制已在其他地方进行了全面综述[2]，在这篇新的评论类型文章中，Mathilde Mathieu等人描述了囊泡（即未来的外泌体）在MVB内部形成的关键实例，以及这些机制是否以及如何适用于在质膜上形成的EV（图2）。

（1） ESCRT。

转运所需的内体分选复合物（ESCRT）是一个蛋白家族，它们在MVB膜上与一系列复合物（ESCRT-0，ESCRT-I，ESCRT-II和ESCRT-III）结合以便调节分子货物靶向运送到ILV中和ILV形成。

在小型EV制备物中存在的TSG101（tumour susceptibility gene 101 protein）和其他的ESCRT蛋白或ESCRT辅助分子，比如ALIX（由PDCD6IP编码）和VPS4（vacuolar protein sorting-associated protein 4），经常被视为它们起源自MVB的证据。

然而，ESCRT因子参与质膜上的各种出芽和膜断裂事件，所有这些事件都需要ESCRT-I/II/III和辅助分子，这样才能导致EV释放。

ESCRT-0组分通常未在质膜出芽和释放模型中描述过。因此，EV分泌的ESCRT-0依赖性可能是一种证实它们起源自MVB的手段。因此，剔除HeLa细胞中的ESCRT-0组分HRS（由HGS编码）或STAM1（signal transducing adapter molecule 1）会减少携带CD63和MHC-II/CD81的小型EV（对应于外泌体）的分泌。

然而，这些方法可能会引起不相关的但容易混淆在一起的影响。比如，在HIV病毒感染期间的HRS剔除通过阻止通常在质膜上截留病毒颗粒的tetherin（由BST2编码）降解而减少了从质膜上释放的病毒。

鉴于tetherin也将源自MVB的外泌体保留在质膜片（plasma membrane patch）上，这可能还减少了外泌体和源自质膜的EV的分泌。HRS结合到蛋白的泛素部分上，从而将蛋白靶向运送到ILV中。

然而，在小型EV中存在的泛素化蛋白并不能支持它们的外泌体性质，这是因为人们尚未证实质膜来源的EV缺乏泛素化蛋白。

相反，在细胞接触1型干扰素后，蛋白随后与泛素样分子ISG15的结合经证实触发MVB-溶酶体融合，从而减少外泌体分泌。

然而，鉴于ISG15的一个至为重要的靶标是TSG101，而TSG101也是质膜来源的小型EV形成所必需的，因此在增强的ISG15结合后观察到的分泌体减少可能并不是外泌体所独有的。

（2） 脂质。

朝着远离细胞质的方向进行出芽的囊泡含有由鞘磷脂酶产生的锥形脂质，如神经酰胺。经证实抑制中性鞘磷脂酶（nSMAse-2，由SMPD3编码）通过一种不依赖于ESCRT的机制阻止MVB中的ILV出芽和外泌体释放。

虽然这篇新的文章并未探究它们对其他EV的影响，但是神经酰胺抑制药物（尤其是GW4869）或靶向nSMAse-2的RNA干扰通常用于证实所分析的EV的外泌体性质，和/或一种特定功能依赖于外泌体的性质。

然而，影响神经酰胺产生途径会影响许多其他的细胞特性。具体而言，GW4869可通过一种不依赖于nSMAse的机制诱导稍大一些的质膜来源的EV的补偿性分泌或细胞死亡。

此外，nSMAse控制着通用的后高尔基体转运（post-Golgi trafficking），因而潜在地控制着所有分泌。神经酰胺还调节可能间接影响MVB稳态的自噬。

一般而言，在解释化合物或对基因表达进行调节对EV分泌的影响时，应考虑对细胞死亡和自噬的影响。

在秀丽隐杆线虫中，磷脂酰乙醇胺的外部化导致EV出芽和释放，其中磷脂酰乙醇胺通常通过翻转酶（flippase）维持在质膜的胞质面上。

在哺乳动物细胞中，磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺不对称性的丧失也导致质膜来源的囊泡出芽，并且两个具有促翻转酶（scramblase）活性的蛋白家族参与这个过程。然而，这些机制对外泌体分泌的影响尚未被探究过。

（3） 多配体聚糖（syndecan）和多配体聚糖结合蛋白（syntenin）。

将跨膜蛋白特异性地靶向运送到MVB的ILV中也能够通过蛋白-蛋白相互作用发生。

多配体聚糖结合蛋白-1（syntenin-1，由SDCBP编码）在与多配体聚糖-1（syndecan-1）的胞质结构域结合后，招募ALIX，接着与ESCRT-I-III组分一起，允许向内出芽进入ILV中以及随后在含有外泌体的沉淀中回收多配体聚糖结合蛋白和多配体聚糖-1。

这种机制依赖于Src介导的多配体聚糖-1内吞作用，并且需要磷脂酶D2和ARF6（ADP-ribosylation factor 6, ADP-核糖基化因子6）的GTP酶活性。

然而，该途径可能不是所有细胞类型中MVB来源的外泌体特有的。在树突细胞和脂肪细胞中，多配体聚糖结合蛋白在小型EV（特别是对应于外泌体的那些EV）中最为丰富，但是也在较大的EV中检测到。

此外，ARF6也是肿瘤细胞释放较大的EV所必需的。

（4） MVB酸化。

沿着内吞途径的逐步酸化是内化组分的降解和再循环所必需的。

Atg5（Autophagy protein 5, 自噬蛋白5）和Atg16L1将V1-ATP酶的E1亚基（由ATP6V1E1编码）解离并因此清除它的质子转运蛋白活性，或者巴弗洛霉素（bafilomycin）处理，均可降低MVB酸化并增加人细胞中的外泌体分泌。

这表明pH值可能是MVB作为分泌区室（secretory compartment）还是降解区室（degradatory compartment）的决定因素。

或者，增加的外泌体分泌可能是由于内吞作用减少和由MVB功能发生改变的细胞分泌的外泌体发生降解，或者是由于巴弗洛霉素对高尔基体运输的间接影响。

虽然当前关于外泌体MVB中的生物发生的讨论并不详尽，但是需要考虑的一个关键点是在目前已知的生物发生机制中，没有一种机制是完全是外泌体途径特有的，或者在所有细胞类型中都是有效的。

外泌体和EV分泌的胞内转运

只要允许MVB转运至质膜并与质膜融合的细胞内转运分子是外泌体分泌所特有的，那么它们也可允许区分外泌体与质膜来源的EV。

（1） Rab GTP酶。

Rab家族的小GTP酶成员在胞内区室之间转移囊泡方面发挥了良好的作用，并且还涉及MVB转运到质膜上以便释放外泌体。

比如，破坏Rab27a或Rab27b会改变MVB形态并及其在质膜上的停靠，这表明它们在外泌体分泌中发挥作用。虽然多项研究均未评估操纵Rab27a/b对其他EV分泌的影响，但是单独抑制Rab27a会以一种依赖于MVB的方式降低HIV从质膜中分泌出来。

这一观察结果是否也适用于非病毒诱导的质膜来源的EV仍然是不清楚的，但是在理解Rab27抑制的EV相关影响时，这一点是值得考虑的。

除了MVB之外，Rab27a/b参与Weibel-Palade 小体和高尔基体来源的分泌颗粒的分泌。因此，正如在剔除Rab27a的肿瘤细胞中对一些可溶性非EV相关蛋白所观察到的那样，Rab27a/b抑制可能影响存在于这些颗粒内的可溶性组分的分泌。

基于此，利用Rab27a/b抑制来证实外泌体或小型EV参与其中需要额外的步骤，比如通过外源性的外泌体或小型EV拯救表型。

同样的考虑适用于促进外泌体或小型EV分泌的其他小GTP酶。比如，抑制Rab11a、Rab35或Rab7导致小型EV恢复减少。

然而，Rab11和Rab35在早期内体或再循环内体中起作用，从而提高了释放的囊泡来自早期内体或甚至来自质膜的可能性。

有趣的是，在细胞毒性T细胞中，Rab27a+晚期内体与Rab11a+再循环内体之间的融合由Rab27a效应物Munc13-4（由UNC13D编码）介导，并且是调节细胞毒性颗粒与质膜之间的融合所必需的。

类似地，Rab11a和Rab27a交谈可能参与最近描述的在人癌细胞系中发生钙离子诱导的Rab11a-Munc13-4依赖性的外泌体分泌。

总之，这些研究表明细胞类型、环境和对处于稳定状态或诱导时的EV分泌进行的分析（比如，通过钙离子水平增加或其他方式）可能影响小型EV和/或外泌体分泌的机制，因此一种具体的实验条件可能并不适用于其他的实验系统。

（2） SNARE。

Rab GTP酶可能在比较早的或复杂的细胞内转运步骤中起作用，从而用于调节外泌体分泌。

因此，研究外泌体生物发生的一个主要目的是鉴定MVB与质膜融合所特别需要的SNARE复合物。人们已发现YKT6 SNARE是携带Wnt的外泌体分泌所必需的，并且据报道Syx-5（秀丽隐杆线虫中的一种与syntaxin-5存在同源关系的蛋白）通过Ral-1小GTP酶将MVB靶向质膜。

然而，鉴于这两种SNARE都涉及内质网-高尔基体转运，对它们的抑制也必然会影响正常的分泌途径。

特别地，科学家们已发现作为一种神经元特异性的参与突触小泡分泌的SNARE，syntaxin-1A影响果蝇中的外泌体分泌。

在HeLa细胞中，在组胺处理后，作为一种质膜相关的SNARE，SNAP-23（synaptosomal-associated protein 23, 突触体相关蛋白23）自发地介导MVB-质膜融合。尽管这些SNARE参与更靠近质膜的融合事件因而可能不会干扰上游转运，但是它们也可能参与分泌颗粒的分泌。

在细胞水平上可视化观察MVB运输和EV释放也可区分分泌途径和降解途径。

比如，联合使用pH敏感性的荧光CD63构建体和光电关联显微镜（correlative light-electron microscopy），允许对MVB与质膜之间的融合进行明确的可视化观察和定量分析。然而，该途径与直接质膜出芽或与较弱酸性的区室之间的融合作出的相应贡献是无法确定的，这是因为后面的事件不能通过这种类型的pH敏感性的实验系统来加以量化。

（3）细胞骨架。

EV的出芽和释放需要质膜下的肌动蛋白聚合发生变化以及随后在由小GTP酶RhoA精心协调的过程中发生肌动球蛋白细胞骨架收缩。

然而，人们尚未探究MVB周围的肌动蛋白池（actin pool）的状态及其对ILV形成的潜在影响。皮质肌动蛋白的解聚也可能是允许MVB停靠在质膜上以便外泌体在随后释放所必要的。

因此，靶向肌动蛋白聚合可间接地促进外泌体分泌。类似地，这种微管网络很可能是将MVB转运到质膜上所必需的；然而，尽管对它进行药物抑制会降低外泌体分泌，但是它也影响其他的质膜来源的结构域，比如纤毛或纳米管。

因此，尽管细胞骨架成分可能在是分泌外泌体还是分泌质膜来源的EV中起重要作用，但是靶向它们也可能诱导多种非特异性的作用。

包膜病毒与外泌体和其他的小型EV相比较

包膜病毒出芽与小型EV的生物发生有许多相似之处。

病毒在病毒颗粒组装和出芽的不同步骤中使用宿主细胞内的运输机制，而对EV而言，这些步骤可能根据病毒和宿主细胞的不同在不同位置发生。

在HIV-1中，病毒组装发生在T细胞的质膜上，而在巨噬细胞中，它发生在内部区室中。在膜出芽部位招募HIV-1 Gag蛋白对于病毒组分的最终组装是必需的。Gag还会招募ESCRT复合物，包括TSG101和ALIX，它们最终通过膜裂变事件介导新生颗粒的释放。

Gag的核衣壳结构域能够模拟多配体聚糖结合蛋白的PDZ结构域来捕获ALIX，这就使得多配体聚糖结合蛋白能够在HIV-1出芽期间替代核衣壳功能。

与较大的EV和含有多配体聚糖结合蛋白的外泌体相比，HIV-1出芽并不依赖于ARF6 GTP酶，但它还涉及许多已知也促进EV分泌的Rab蛋白，包括Rab9、Rab7a、Rab27a、Rab14和Rab11-FIP1C。

Rab14是个例外，它在EV调节中的潜在作用仍有待研究。SNARE也参与HIV和EV释放。对SNARE机制的抑制证实它在Gag蛋白定位到质膜上发挥作用，因此，也在HIV-1装配中发挥作用。

然而，尚未确定的是一些SNARE是否是EV特有的而不会影响HIV颗粒。

最后，HIV-1组装涉及丝状肌动蛋白结构的形成，这种结构会在病毒出芽后消失。虽然干扰肌动蛋白的药物会减少病毒产生，但是如前所述，它们也可能影响EV的释放。由于这些过程的许多方面仍然在很大程度上是未知的，因此有必要鉴定和描述调节EV和病毒产生的特定步骤的各个分子。

HIV-1病毒的直径大约为120nm，与外泌体和小型EV的直径相当。这些膜包围结构还具有其他的物理和分子特征。

比如，HIV-1病毒颗粒和小型EV的脂质组合物包括高比例的胆固醇、鞘磷脂和饱和脂质，并且它们都具有相同的膜定位。HIV-1病毒颗粒膜也富含CD63和CD81四跨膜蛋白，其中这两种四跨膜蛋白存在于小型EV上。

这些相似性使得在受到病毒感染的细胞中将病毒颗粒和EV分离开来特别具有挑战性。比如，小型EV和HIV-1病毒颗粒在蔗糖密度梯度中达到相同的平衡密度。

更为复杂的是，受到病毒感染的细胞产生经过修饰的整合着病毒基因组片段和病毒蛋白的EV，这意味着经典的纯化技术导致这些组分共纯化。

因此，在HIV-1感染期间对小型EV功能的研究受到难以获得不含HIV的EV制备物的阻碍，这可能解释在诱导前病毒EV反应和抗病毒EV反应方面存在相互矛盾的报道。

参考文献：

1. Mathilde Mathieu et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology, January 2019, 21(1):9–17, doi:10.1038/s41556-018-0250-9.

2. Van Niel et al. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19, 213–228.

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