陶军:内皮微颗粒:囊泡转运与血管功能调控·365医学网

微颗粒（Microparticles，MPs）是细胞激活、损伤或凋亡时从浆膜上通过出芽方式形成并进入循环的、携带来自母细胞某些抗原特性的亚微米级囊泡 。 MPs是胞外囊泡的一种，胞外囊泡根据直径大小分为：外泌体（30-100nm）、MPs（100nm-1μm）和凋亡小体（1μm-4μm）。在内稳态失衡时，血管内皮细胞与其他细胞一样能释放膜囊泡——EMPs，调控血管功能。本文将对EMPs与血管功能调控做一简单综述。

1、 EMPs的特征

　 所有类型的血细胞都可以释放MPs，其中血小板来源的MPs（platelet microparticles, PMPs）数量最多，其在19世纪60年代被发现并称之为“血小板尘埃（Platelet Dust）”，具有很强的促凝血作用。EMPs由内皮细胞胞膜出泡所形成，EMPs浆膜表面表达一系列与凝血反应、细胞增殖和凋亡、炎症反应、氧化应激、细胞粘附、蛋白水解、新生血管形成及肿瘤增殖等相关的信号分子，如血管内皮钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin），血小板内皮细胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1），细胞间黏附分子（intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1），内皮素（endoglin），E选择素（E-selectin），黑色素瘤黏附分子（Melanoma Cell Adhesion Molecule, Mel-CAM）或整合素（integrin） 。通过检测这些表面分子能够鉴定出EMPs。但除了E-选择素和血管内皮钙粘蛋白外，大部分都是非内皮特异性的。因此，需要联合检测多种表面分子以排除其他微颗粒亚群的干扰，提高特异性和敏感性。MPs带有从母细胞获得的功能性受体、蛋白质、生物活性脂类和核酸物质，在细胞间信号传递中起信使和效应器的作用。EMPs的蛋白组成高度依赖于刺激物的种类。EMPs蛋白组学研究发现EMPs内含有一定数量来自母细胞内质网、线粒体和核糖体的蛋白质，提示母细胞的细胞器参与MPs的形成过程 。目前仍然缺乏EMPs脂质组学的研究。Valadi等首次发现肥大细胞产生的外泌体（exosomes）中含有非编码miRNAs，并且能够传递给靶细胞 。从健康人血浆中分离出来的MPs和外泌体含有miRNAs。间充质干细胞来源的MPs含有核糖体蛋白，参与胞内RNA的储藏及运输，表明MPs可能在胞内不同区域间传递RNA等核酸物质 。由上述证据可见，EMPs能通过向靶细胞转运RNAs发挥生物学作用。miRNAs是如何选择性装入囊泡中以及如何转运、识别和被靶细胞利用需要进一步深入的研究。
　 一项针对胚胎干细胞来源的MPs刺激造血祖细胞增殖分化的研究首次发现胞外微囊泡能携带并向靶细胞传递信号分子 。胚胎干细胞来源的MPs通过激活p42/44和Akt通路诱导早期多能干细胞和造血干细胞的分化。与来源的胚胎干细胞相比，MPs携带有更多的Wnt3蛋白和多能转录因子的mRNA，并且这些mRNA能直接传递或翻译成蛋白质进入靶造血干细胞。
　 Hergenreider等人研究证明内皮细胞高表达抗动脉粥样硬化相关转录因子KLF2或在切应力作用下能提高释放的EMPs中miR-143 和miR-145的含量。这些EMPs能将携带的miR-143/145转运至目标平滑肌细胞（Smooth Muscle Cell,SMCs）中，调节SMCs基因的表达水平 , 。另外，EMPs将功能性microRNA-126运载至内皮细胞，调节目标SPRED1蛋白，促进血管内皮修复 。

2、 EMPs的形成和释放机制

　 内皮细胞在受到激活或者凋亡时，胞内钙浓度上升，激活拼接酶（Scramblase）和钙蛋 白酶（Calpain）并抑制移位酶（Translocase），破坏胞膜磷脂双分子层的不对称性分布，使磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）暴露出来，细胞膜骨架蛋白重构，EMPs形成 。与血管内稳态相关的促炎因子，促凋亡因子，促凝血因子以及变性脂质和毒素，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α） ，C-反应蛋白（CRP） ，凝血酶（thrombin） ，纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1） ，血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II） ，细菌脂多糖（LPS） ，尿毒毒素 ，三氧化二砷 和氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL） 均能刺激体外培养的内皮细胞释放EMPs。但目前仍然缺乏上述生物因子在体刺激EMPs释放机制的研究。Boulanger等发现低切应力和终末期肾病患者体内EMPs水平相关 ，Vion AC等进一步研究发现，低切应力通过激活ROCK(Rho kinases，ρ激酶)和ERK 1/2(extracellular signal-regulated kinase，细胞外信号调节激酶)刺激EMPs释放而高切应力通过NO介导调节ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1, ATP结合盒转运蛋白A1）表达及细胞骨架重构限制EMPs释放 ，表明血流动力学改变也能刺激EMPs的释放。
　 目前针对EMPs形成与释放的分子调控机制研究仍然缺乏。Sapet等人利用微阵列分析技术研究EMPs形成的基因转录过程，发现凝血酶刺激后，微血管内皮细胞中与细胞骨架重构相关的基因表达增强，其关键信号通路是NF-κB-Rho kinase (ROCK) II -caspase-213，利用细胞松弛素B（Cytochalasin B）阻断该通路，抑制细胞骨架微丝形成能减少MPs的释放5。ROCK的激活与血管重构及高血压病密切相关 ，利用ROCK抑制剂减少EMPs生成可能成为改善血管功能异常的新手段。Simoncini等人研究发现凝血酶刺激内皮细胞后，TNFα超家族成员—可溶型肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL）释放增加，TRAIL与TRAIL-R2结合，启动下游转录因子NF-κB，导致EMPs的释放，敲除TRAIL基因的内皮细胞在凝血酶刺激下EMPs释放显著减少，表明TRAIL是EMPs释放的关键信号分子 。利用甲基β环糊精（methyl-β-cyclodextrin ，MBC）和制霉菌素破坏胞膜上的脂质筏（lipid rafts），会导致EMPs水平降低，表明脂质筏可能是EMPs形成的膜位点。
　 有人提出胞内调控EMPs释放的信号通路与炎性反应密切相关。Curtis等人发现p38-MAPK通路与TNFα介导的促炎性反应EMPs释放有关，口服抗血小板药物氯吡格雷作用于p38-MAPK信号通路，能减少体外培养人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）形成MPs ，证实p38-MAPK信号通路参与了EMPs的生成 。

3 EMPs的生物学效应

3.1 EMPs促进凝血和血栓形成
　 在动脉粥样硬化斑块中及急性冠脉综合征患者体内均发现具有促凝血功能的EMPs存在。EMPs表面有带负电荷的磷脂，尤其是磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）与凝血因子带正电荷的γ-羧基谷氨酸结构域相结合，为凝血因子形成复合物提供锚定位点，能启动瀑布式凝血反应 ，表明EMPs具有促进凝血的作用。另外，多项体外实验研究已经发现TF 的EMPs亚群11,15,18。组织因子（Tissue factor，TF）与因子Ⅶ/ Ⅶa 结合后启动外源性凝血级联反应 。EMPs通过表面的组织因子介导促凝血反应和血栓形成已经被确认 。TF EMPs表达内皮黏附分子和ICAM-1，与单核细胞表面的integrinβ2亚基相结合，将TF转运到单核细胞上，增强其TF依赖的促凝血功能27, 。EMPs表面携带有蛋白酶，如TNF-α转化酶（Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme, TACE/ADAM17），能水解内皮细胞表面的跨膜蛋白，使内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C receptor, EPCR）脱落，抑制EPCR介导的抗凝作用，增强内皮细胞的促凝血功能 , , 。然而，最新研究发现EMPs表达尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator， U-PA）及其受体介导纤溶酶的合成，起抗凝作用 。表明EMPs可能在凝血/抗凝血反应中起重要调节功能。

3.2 EMPs与炎症反应
　 炎性介质，如TNFα, IL-1β 和凝血酶等能刺激EMPs的生成，EMPs又以旁分泌的方式促进血管炎症的发生，形成瀑布样炎性反应1。TNF-α刺激EMPs释放的同时，EMPs分泌可溶型ICAM-1增加，放大内皮环境炎性反应。目前研究发现EMPs能反映细胞活化状态及全身性炎症反应水平，提示EMPs可能是炎症反应的始动因素或产物。在健康年轻男性体内发现EMPs水平与IL-6及CRP浓度相关，表明EMPs的形成与低水平炎症反应有关 。动脉粥样硬化、糖尿病和自身免疫性疾病（如多发性硬化及SLE）等存在炎症反应病理基础的疾病患者体内循环EMPs水平升高，提示长期慢性炎症可能促进EMPs的释放。EMPs促进炎症反应的发生并形成瀑布样级联反应的机制目前尚未明确。在体外，EMPs通过向幼稚内皮细胞传递ICAM-1 mRNA、转录因子和miRNA上调ICAM-1基因的转录和翻译，促进炎症反应25。研究发现，给小鼠静脉注射EMPs后，其血液及肺泡中的IL-1β 和TNFα浓度升高，同时向肺泡趋化的中性粒细胞数量明显增多。由于IL-1β缺乏分泌信号肽，MPs转运机制在ATP活化的肥大细胞外分泌IL-1β中起到重要作用 。

3.3 EMPs和新生血管形成
　 新生血管形成是在内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等细胞因子信号通路调控下由原有的脉管系统形成新的毛细血管。有研究表明，T淋巴细胞来源的MPs（T-lymphocyte-derived microparticles, TMP）促进ROS生成，抑制血管新生和内皮细胞功能 。目前大部分研究显示EMPs抑制血管生成，但具体机制不明。HUVECs来源的EMPs抑制血管生成的作用能被胞膜的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）阻断，表明ROS在EMPs抑制血管生成中起重要作用 。给予高脂饮食Ldlr-/-小鼠静脉注射EMPs，发现其通过影响eNOS和NO的合成抑制心脏血管的再生 。2型糖尿病患者疾病严重程度与EMPs水平呈正相关。最近一项针对健康人和2型糖尿病患者血浆MPs对于内皮血管新生作用的研究发现， 2型糖尿病合并冠状动脉病患者血浆MPs抑制内皮新生血管形成 ，表明EMPs抑制血管生成，加重存在血管生成障碍病理基础的疾病如糖尿病等的严重程度。然而，有另外一些研究得出相反的结论。Leroyer等研究发现CD40 MPs能通过诱导VEGF的表达和激活PI3K/AKT信号通路，刺激内皮增殖，促进在体新生血管的生成，导致动脉粥样硬化斑块内出血 。EMPs表面的integrnα4 和β1（integrins α4 andβ1）为其与内皮细胞的识别和结合提供了锚定位点，将mRNA传递给内皮细胞，通过磷酸化作用激活PI3K-Akt通路和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，促进血管新生 。

4 EMPs—血管功能损伤的新指标
　 1999年首次发现在患者体内MPs水平明显升高11，并提出MPs可能是疾病诊断和预
后的新指标。内皮细胞激活或凋亡时最早的生物学反应之一就是囊泡的释放。虽然EMPs只占循环MPs很少一部分，但其血浆水平的变化对于评估血管功能损伤和心血管疾病具有重要意义。在急性冠脉综合征（ACS）、动脉粥样硬化、卒中、高胆固醇血症、代谢综合征、肥胖、糖尿病、外周血管病、高血压和心衰等存在血管壁病理基础的疾病中，循环EMP的水平明显升高，提示EMPs与血管疾病的发生和转归相关42-48。一项涉及350名心血管疾病高危患者的前瞻性研究发现VE-cadherin (CD144 ) EMPs 是心血管事件发生的独立预测因子，联合其他标志物（如BNP、hsCRP等）能有效预测高危患者心血管事件的发生几率 。肺动脉高压患者CD62e （E-selectin）EMPs计数（＞353/µl）与不良事件的发生呈正相关。EPCs具有修复内皮损伤的作用，EPCs和EMPs的平衡能维持血管内皮完整性，保护内皮功能。多项研究证实EMPs与EPCs的比值是高危人群血管功能的评价指标45, 。ST段抬高性心梗（ST segment elevation myocardial infarction, STEMI）患者责任动脉内的EMPs水平明显高于循环，且与血栓积分（thrombus score）相关，同时，责任动脉内的EMPs与STEMI患者pPCI术后微动脉栓塞（microvascular obstruction，MVO）预测指标直接相关 。
　 现有的血管功能检测方法有血流介导舒张功能（Flow-Mediated Dilatation）、血管造影乙酰胆碱灌注、脉搏波速度（Pulse Wave Velocity）和生物分子指标。Boulanger等人在终末期肾病患者中发现，EMP的水平与FMD下降程度高度相关(r=-0.54，P=0.004) 。我们课题组的一项关于高血压病患者循环内皮微颗粒水平和动脉弹性功能的关系的研究发现，EMPs水平与肱踝PWV呈正相关 (r=0.42，P＜0.001) 。这些指标只能评估血管某一方面的功能，而EMPs作为血管分子病理学指标能综合反映血管内稳态状况 。因此，EMPs可能成为血管内皮功能障碍新的生物学标记物。

5 EMPs与血管功能和内皮稳态调控
　 EMPs参与促凝/抗凝反应、炎性反应和内皮损伤修复/凋亡，对内皮微环境稳态和血管功能起调控作用。内皮微环境是炎症反应、凝血反应、血管舒缩活动、血管新生和重构等血管生物学行为发生的场所。EMPs能通过形成不同的亚群，利用不同的信号通路调控上述血管生物学行为。最初的研究结论是EMPs可反映内皮细胞功能障碍，并通过促炎、促凝、抑制NO产生等方式参与内皮细胞损伤。然而，有最新研究表明EMPs具有内皮保护及抗凋亡的作用。Mause等人研究发现PMPs通过上调早期成血管细胞（Angiogenic early outgrowth cells, EOCs）表面内皮标志物的表达，转移基质细胞衍生因子受体(Cxc Chemokin Receptor 4, CXCR4)至EOCs，增强其与配体CXCL12/SDF-1α的相互作用，提高EOCs的增殖、迁移及分泌成血管因子的能力，修复血管内皮损伤 。Abid Hussein等人研究发现EMPs通过阻断内皮细胞caspase-3，阻止内皮细胞凋亡，首次证明EMPs具有抗凋亡作用 。EMPs携带EPCR和活化蛋白C（activated protein C, APC）具有细胞保护和抗炎效应，维持内皮细胞存活 。
　 NO是最重要的血管舒缩功能调控因子。EMPs可能通过调控NO的生成和生物利用度对血管功能起负性作用。在急性肺损伤时，纤溶酶原激活物抑制剂（plasminogen activator inhibitor, PAI-1）刺激产生的EMPs通过抑制内皮介导的血管舒张功能和减少eNOS合成的NO加重肺损伤 。王洁梅等发现CRP刺激HUVECs产生的EMPs能抑制四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4）依赖性NO的合成 。在缺氧条件下， MPs通过调节NOS的磷酸化水平，抑制NO合成，损伤血管舒张功能。在健康人体内，短时间二手烟吸入导致血管内皮急性损伤的同时，EMPs的水平显著降低，NO释放减少，EPCs功能受到抑制 。
　 EMPs通过调节内皮稳态发挥一系列的生物学效应。EMPs参与炎症反应、促凝血反应和新生血管形成等负性生物学行为，然而其也有维持内皮稳态的作用。出现这种矛盾的原因在于EMPs结构及组成的复杂性，蛋白组学分析表面1/3的EMPs蛋白高度依赖于刺激物的种类，从而形成具有不同表型的EMPs亚群。整合上述研究结果发现，不同表型的EMPs在内皮稳态调节中发挥不同作用。

6 结语

　 大量实验研究证明，EMPs在血管功能信号调控中起重要作用。同时，囊泡通过复杂有
效的分子调控机制调节细胞内环境的稳态。EMPs调节异常可以作为血管功能障碍的预警信号。人们希望降低心血管危险因素能减少EMPs的形成，从而改善预后。目前正在进行的多项大型多中心临床研究将会探究囊泡转运在血管功能调控中的重要意义。充分阐述囊泡的生成、生物学效应及其在疾病发生发展中的作用将有助于深入理解EMPs与血管功能的关系。