食用菌母种生产技术

食用菌母种生产技术

母种生产主要包括培养基制备、纯种分离或转管扩大、培养等环节。
一、母种培养基制备
1.母种培养基常用配方
（1）PDA培养基：马铃薯(去皮，下同)200克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，水l000毫升。
（2）加富PDA培养基
①综合PDA培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾3克，硫酸镁1.5克，维生素B110毫克，琼脂18-20克，水1000毫升。
②蛋白胨－综合PDA培养基：在加富PDA培养基①中添加5克蛋白胨。
③麦麸－PDA培养基：在培养基（1）中添加100克麦麸。
④麦芽汁－PDA培养基：在培养基（1）中添加50克大麦芽。
（3）鲜蘑菇浸出液培养基：鲜蘑菇200-250克，葡萄糖20克，琼脂18-20克，水1000毫升。将蘑菇切碎，煮30分钟，取其液汁。
（4）粪汁培养基：干马粪或牛粪150克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。将马粪或牛粪打碎，煮沸30分钟，取其溶液。
（5）完全培养基（CM）培养基：蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾0.46克，硫酸镁0.5克，磷酸氢二钾1克，琼脂18-20克，水1000毫升。
2.母种培养基制作方法
不同配方培养其制作方法基本相同，现以综合PDA培养基为例介绍其制作方法。
（1）培养基制作。将土豆洗净、去皮、挖去芽眼及变青绿部分，称取200克，切成约长宽各2厘米厚3毫米左右的薄片，在1200毫升水煮沸10－15分钟，然后用4－6层纱布过滤，倒掉残渣并洗净铝锅。将滤液倒入锅内，加清水补足1000毫升，同时放入琼脂并重新开始加热，最好小火加热，不断搅拌至琼脂完全溶化，再用纱布过滤一次，补水至1000毫升。最后依次将称好的葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素加入，继续加热并搅拌至全部溶化，停止加热。如果要加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化后加入，可以避免蛋白胨因结块而分散不均。
图3－11试管分装
（2）分装试管。左手持3-4支试管，管口朝上，令下端整齐，上移试管至漏斗软管，插入试管内约3厘米。右手捏紧软管止流夹，使培养基液体流入试管，准确掌握液体培养基装入试管的数量，直立试管时液体高度约为试管长度的l／5即可。此时松开止流夹液体停止流入。将试管下移离开软管，再分装第2支试管，周而复始，直至全部装完。分装试管要求速度快，尤其在低温季节操作，以防止培养基凝固。装量要准确，因为装量偏多摆成的斜面变短，又浪费培养基。装入量偏少则使摆成的斜面太薄，营养少，菌丝难以正常生长。注意避免将培养基沾附到试管管口，以免造成粘着棉塞现象，还易引起棉塞上滋生杂菌，给菌种质量留下隐患（图3－11）。
图3－12棉塞制作步骤
（3）棉塞制作。试管分装好后，要塞好棉塞，棉塞要用普通棉花，不能用脱脂棉。棉塞制作方法多样，现介绍一种常用制作方法：取棉花适量，做成一均匀片（步骤1），从一边向里折叠，使之成为一条整齐的边（步骤2）。再将相邻的另一边向里折叠，使第二边与和第一边成直角（步骤3）。顺着第二边将棉花卷紧（步骤4），成为柱形，末端的棉絮自然平贴在棉柱上（步骤5）。将毛茬的一边折转平贴在棉柱上（步骤6），将此端塞入试管口。棉塞的2/3塞入试管中，管外留1/3（步骤7），制作过程如图3－12所示。（4）试管包扎。试管塞好棉塞后，取7支同样规格的试管，用牛皮纸或双层报纸将棉塞端包住，并向下延伸到试管中部，用粗棉线将其扎成一把。
（5）培养基灭菌。母种培养基多采用手提式高压灭菌锅进行灭菌，灭菌操作过程如下：
①检查高压蒸汽灭菌锅的压力表及各部位是否灵活、可靠，尤其注意检查安全阀是否发生堵塞或锈死。
②加水。在锅内加入约3千克自来水，加至支架下缘。
③装培养基。将捆好的培养基棉塞向上垂直放入灭菌筐（桶）。
④封盖。将锅盖上垂下的排气管插入套筒内壁的导气管中，然后用双手同时用力，分别将对角线方向的两个螺丝拧紧。
⑤排冷空气。封盖后关闭排气阀开始加热，当加热至压力达0.05兆帕时，打开排汽阀，排尽冷空气，待压力降至零后，即可关闭排气阀。最好依上法排两次。继续加热，当压力升至0.11兆帕时，开始计时，在0.11－0.14兆帕压力下保持30分钟，停止加热。使其自行冷却降压至0。打开排汽阀，再将锅门打开一条10厘米左右的缝隙，利用锅体余热将棉塞烘干。如果不进行棉塞烘干的程序，棉塞潮湿易滋生霉菌。
图3－13摆放斜面
（6）摆放斜面。观察到报纸干燥后，打开锅盖，当培养基温度降到60℃左右时及时取出摆放斜面。如果在桌上放置1厘米高的小木条，将试管斜放其上，摆成斜面。注意培养基要盖住试管底，斜面长度应以试管长度的1/2左右为好，最多不超过试管长度的3/4（图3－13）。当试管内培养基完全凝固后收起备用。制备好的培养基应放置在通风干燥处保存。如果温度很高时就摆放斜面，培养基凝固后表面会出现较多的冷凝水，不利菌丝生长。在摆放好斜面后，用厚实的棉布覆盖住培养基，使培养基缓慢降温冷却，也可减少冷凝水出现。
（7）无菌检查。随机抽取几支试管放入37℃左右恒温箱中培养2-3天，若无杂菌生长便可放心使用。
（8）灭菌锅的维护。灭菌结束后，应趁热将国内余水倒掉，当锅内壁干燥后盖好锅盖，将表面擦拭干净后妥善保存。

照片名称：QQ截图未命名1


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二、纯种分离
采用无菌操作的方法，利用双孢菇的子实体组织、孢子或菌丝束进行分离纯化，经过培养获得纯菌种的方法叫纯种分离。纯种分离方法主要有组织分离法、孢子分离法和菌丝束分离法。组织分离法属于无性繁殖的方式，操作简单，能够保持亲本的优良性状，是生产中最常用的菌种分离方法；孢子分离法又分为多孢分离法和单孢分离法，一般用于菌种选育或杂交育种；菌丝束分离法不常用。
下面以组织分离法为例介绍纯种分离的方法。
组织分离法是切取双孢菇的一部分菇体组织，放在培养基上，培养出纯菌种的方法。一般取菌肉组织作为分离物。
1.种菇选择。种菇应从没有严重病史的菇房内采集。采集种菇的菇床应该无病虫害发生，菌丝生长健壮，出菇均匀，转潮快。应选择菇形圆整，菌盖肥厚，表面光滑，菌柄粗壮，无杂菌感染，无病菌虫害的前二茬单生菇作为种菇。一般选用内菌幕未破的8成熟的子实体做种菇。
2.接种场所的消毒。选择在接种箱或净化工作台上进行分离均可。在接种箱内分离前，应将解剖刀、接种钩、待接种的母种培养基、酒精灯、火柴等放入接种箱内，用甲醛和高锰酸钾（甲醛用量10－14毫升/立方米，高锰酸钾用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分钟。在净化工作台上分离前，应提前打开鼓风机30分钟，排除台面上含有杂菌的空气后再进行操作。
3.种菇消毒。将切去部分菌柄的种菇，用75%的酒精棉球进行表面消毒。
4.手及接种工具的消毒。用75%的酒精对双手及接种工具进行消毒。
5.分离过程。将消毒后种菇带到接种箱或净化工作台内，点燃酒精灯，先将解剖刀、接种构进行灼烧灭菌，然后用手指将种菇纵向掰开，用冷却后的解剖刀切取菌盖与菌柄交接处的一小块菌肉组织，切好后放在原处。组织块大小应适中，一般长宽各为0.5厘米，厚约3毫米的。太大污染几率提高，太小不易成活。放下解剖刀，左手拿一支母种培养基和半个蘑菇，右手拿起冷却后的接种钩，挑取切好的组织块迅速转移到斜面培养基中央，并用接种钩轻压以防滑动，塞好棉塞。重复以上操作，一般需分离7管以上。
6.写标签。分离结束后，将7支试管包扎成一把，在顶端报纸上注明品种名称、分离日期等。
7.培养。将分离后的试管放置在24－25℃的恒温培养箱中控温培养3-4天，就可发现褐色组织块（因多酚氧化酶反应而致）上生出白色绒毛状菌丝。继续培养20天左右，菌丝即可长满斜面。培养过程中应经常进行检查，发现有细菌或者霉菌污染，以及菌丝生长异常的应及时淘汰。
8.纯化。通过组织分离获得的母种，及时从外观看不到杂菌感染也不能直接用于生产原种，这是因为组织块上可能潜伏着少量杂菌，所以需要经过纯化才能用于下一步生产。纯化过程同下述转管过程。要求挑取远离组织块的菌丝进行转接。
三、转管扩大繁殖
转管扩大繁殖母种简称转管，是为了扩大母种数量，采用无菌操作技术，将母种中的一小块菌丝（带培养基）转移到新的试管斜面上，菌丝蔓延长满斜面后获得继代母种的方法。过程简述如下：
1.母种选择。选择种性好，纯度高，生长均匀，菌丝健壮浓密的母种进行转管，特别要检查棉塞是否有松动，棉塞上是否有杂菌。
2.接种场所的消毒。同上。
图3－14母种转接过程
3.母种消毒。用75％酒精棉球将试管外部擦拭—遍。4.手及工具的消毒。同上。
5.转管过程。将选好的母种和斜面培养基两支试管用左手大拇指和其它四指握住使中指位于两试管间的空隙。斜面向上，并使它们处于水平位置。右手拿住接种钩，在火焰上方进行灼烧，接种钩上方可进入试管的部分都要进行灼烧，用右手小指、无名指和掌根同时拔掉两个试管的棉塞，并用手指夹紧。以火焰灼烧试管口，灼烧时不断转动管口，烧死管口上可能附着的杂菌。将灼烧过的接种钩伸入菌种管内，先接触试管内壁，使其冷却，再将其爬壁的气生菌丝体钩掉，并将培养基尖端最薄处约1厘米长的一段切断，连同气生菌丝体一并钩出试管外，再将接种钩重新伸进种源试管内将母种培养基连同斜面表层菌丝体挖取少许（约3－5毫米见方），用接种钩托住慢慢外移。当接近试管口时，要迅速移出，经过火焰送入待接试管内斜面中间部位，并用接种钩轻压以防滑动。抽出接种钩，灼烧管口，塞上棉塞。如此反复操作，1支母种可转接30-50支试管。母种转接过程如图3－14。
6.培养。接种完成后，要将试管重新捆扎，并在每把牛皮纸上如实记录品种名称、接种时间以及操作人员姓名等事项。取出后放在25℃的恒温培养箱中控温培养20天左右菌丝即可长满。培养过程中发现有杂菌感染或者生长异常的要及时淘汰。
由于双孢菇菌丝的生长速度较慢，所以可以在一个母种斜面上转接两个菌丝块，长满试管的时间可以缩短1/2。

一、原种培养基制备
双孢菇原种培养基常用的有麦粒培养基、腐熟粪草培养基和腐熟棉籽壳培养基。其中麦粒培养基最为常用，在麦粒培养基上菌丝生长速度快，菌丝生长旺盛，扩接栽培种或在栽培料上播种后具有生长点多、发菌快等特点，在生产中广泛应用。
1.原种培养基配方
（1）麦粒培养基：小麦98%，石膏1％，碳酸钙1%，含水量50％±1％，pH7.5－8.8。
（2）腐熟粪草培养基：腐熟麦秸或稻草（干）77％，腐熟牛粪粉20％，石膏粉1％，碳酸钙1％，石灰1％，含水量62％±1％，pH7.5。
（3）腐熟棉籽壳培养基：腐熟棉籽壳（干）97％，石膏粉1％，碳酸钙1％，石灰1％，含水量55％±1％，pH7.5。
2.原种培养基制作方法
（1）麦粒培养基制作方法
配方。见前述。
称量。用500毫升的菌种瓶时，一般每瓶用小麦（干）0.2千克左右，用750毫升的菌种瓶时，一般每瓶用小麦（干）0.3千克左右。根据灭菌锅的容量计算后称量。
漂洗。用清水将麦粒漂洗2－3遍，除去灰尘、麦糠等杂物，同时也减少培养基中杂菌的基数。
图3－15麦粒浸泡
浸泡。在制种的前一天下午，用1％的石灰水浸泡小麦，夏天一般浸泡10－12小时，春秋季气温低时浸泡15－20小时（图3－15）。煮沸。小麦捞出后在煮麦锅内煮沸，水沸腾后再煮20分钟左右，当麦粒达到“无白心，不开花”的标准后及时捞出，沥干多余水分。煮麦时加水不可偏少，麦粒成熟度是关系麦粒菌种制作成败的关键。
晾晒。将麦粒摊开，晾去表面水分，麦粒不沾手时及时收起。
加辅料。把石膏、石灰按比例加入，搅拌均匀。
装瓶、加棉塞。麦粒装至瓶肩即可，棉塞大小、松紧度要适宜。
灭菌。采用高压灭菌，灭菌过程参照母种的灭菌，不过，由于麦粒培养基中杂菌基数大，培养基体积大，热不易穿透，控温灭菌时间应保持在2－2.5小时，才能保证灭菌彻底。灭菌是否彻底是影响制种成功率的关键(图3－16)。
冷却。灭菌结束后，自然冷却，当压力回复到0时，打开锅盖，利用锅体余热烘干棉塞，当培养基温度降低到50℃左右时取出，放到干净的地方冷却到常温后才能接种。如果温度很高时就取出培养基，瓶内麦粒上会有大量的冷凝水，对菌丝生长不利。
（2）腐熟粪草培养基制作方法
配方。见上述。
拌料。将发酵后的麦秸或稻草切成2－3厘米的草段，加入牛粪粉、石膏、石灰、碳酸钙等辅料后充分搅拌均匀，加水调整含水量，使含水量达到62％左右。拌料后让培养料吸水平衡2－3小时，再搅拌均匀后即可装瓶。
装瓶、灭菌过程同麦粒培养基制作。由于500毫升菌种瓶瓶口太小，所以一般用750毫升的菌种瓶。为加快菌丝生长速度，装瓶要松紧适度，并用锥形棒在中间打孔直至瓶底。灭菌前要擦洗干净瓶上的碎料，特别是瓶口处要清理干净。
（3）腐熟棉籽壳原种培养基制作方法
配方。同上述。
②拌料、发酵。按照配方将培养料搅拌均匀，加水调整使含水量达到70％－75%，建成宽1.5米，高1.2－1.3米的梯形堆，长度依培养料数量而定，堆上打通气孔。当料温达到70℃左右时进行翻堆，要求将外层培养料翻到中间，中间温度高的培养料翻到外围，以利发酵均匀。以后每间隔3－4天翻堆一次，方法同前。每次翻堆后都要打通气孔。发酵15－18天后，当培养料中出现大量高温放线菌后终止发酵，直接用于装瓶即可。也可以晾干后贮藏备用。
③装瓶、灭菌过程同腐熟粪草培养基制作。
二、原种的接种
将冷却后的培养基装入接种室，移入接种箱，同时放入母种和接种工具，用甲醛和高锰酸钾（甲醛用量10－14毫升/立方米，高锰酸钾用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分钟。也可用气雾消毒剂（5－7克/立方米）熏蒸。
图3－16原种的接种
接种前，双手经75％的酒精表面消毒后伸入接种箱，点燃酒精灯，对接种工具进行灼烧灭菌。然后将菌种瓶放到酒精等一侧，松动棉塞。左手拿一支母种，右手拿接种钩（铲），右手小拇指和无名指夹住试管的棉塞并拔出，用接种钩挑取1.2－1.5厘米见方的母种块，再用小拇指和掌根取下瓶口的棉塞，迅速转移到原种培养基的表面中央，一般菌丝面向上，重新盖上试管和原种瓶的棉塞。重复以上操作，一般每支母种接种4－6瓶原种（图3－16）。 三、原种的培养
培养室有条件的应调温至24℃，空气相对湿度65％，或者常温发菌也可。培养室保持闭光、适量通风，尽量减少人员出入。
培养期间要作好病虫害的检查工作。粪草培养基原种一般在24-26℃下约40天即可发满菌，麦粒基质约30天左右发满。此时可暂存或出售。自用原种须在发满菌后再继续维持7天，此时是最佳菌龄。
栽培种需求量大，每平方米栽培面积需要栽培种1.5－2瓶。栽培种生产主要包括培养基制备、接种、培养和产品质量检查等环节。
一、栽培种培养基制备
图3－17装瓶
蘑菇栽培种培养基的配方其配制与原种制作方法一致，这里不再重复，请参看原种制作方法。装瓶时可以采用集中装瓶法，首先将大量空瓶摆放整齐，用铁锨向瓶上方撒麦粒培养基，当多数的培养基达到500mL刻度时进行适当调整。这样可以提高装瓶速度（图3－17）。
图3－18栽培种的接种


采用高压蒸汽灭菌时，方法同原种灭菌。由于栽培种生产量大，所以也可以采用常压灭菌。采用常压灭菌时，每次将大量培养基装在灭菌筐内，集中堆放，用双层薄膜覆盖，采用锅炉供热蒸汽，100℃灭菌时间24小时，然后再闷10－12小时，去掉薄膜后缓慢冷却到60℃左右时移到干净出冷却至常温。常压灭菌可以提高灭菌效率，满足生产中对栽培种的需要。
二、栽培种的接种
培养基灭菌结束后，一般应待其温度自然降至28℃以下或常温时，再移入接种箱或接种室内常规接种（图3－18）。接种过程与原种接种相似，只不过原种生产是将母种接入原种培养基，而栽培种生产是将原种接种到栽培种培养基。由于栽培种生产量大，所以，可以在接种室内进行接种。
接种时，拔去原种上的棉塞，用冷却后的接种铲将原种表面老化的菌种去掉，再将原种上层的1/3划散，然后取下栽培种培养基上的棉塞，套上一个大小适宜的漏斗，将少量原种倒入栽培种培养基中，使原种均匀分布于培养基表面，用下一瓶的棉塞塞住瓶口。反复进行以上操作，当已划散的菌种用完后，再划下面1/3的菌种，接完后再划底层1/3菌种进行接种。一般每瓶原种接种栽培种30－50瓶。箱内菌种全部接完后移到培养室的培养架上进行培养，并注明品种名称、接种日期、接种人姓名等。
三、栽培种的培养
培养室有条件的应调温至24℃，温度尽量不要超过28℃，空气相对湿度低于65％。培养室应避光、适量通风（图3－19）。要对栽培种进行常规检查。对发生的各种污染，应严格剔出并移出培养室，分类处理。
培养期间要作好病虫害的检查工作。粪草培养基原种一般在24-25℃下约40天即可发满菌，麦粒菌种约25－30天发满。此时可暂存或出售。

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