文献精读秋季班第十二讲内容提要：耐药研究套路
上周更新的文献精读秋季班第十二讲由老谈主讲耐药研究套路。选取文献来自于（2016，IF=12.123）。中文题目为NOX4作为线粒体能量传感器耦合肿瘤代谢重编程和药物耐受。
在肿瘤治疗领域，很多肿瘤患者在接受药物治疗后会出现耐药现象。人类研究耐药机制有了几十年的历史，但是对于耐药机制的理解依旧很肤浅。
在正常细胞内，氧气充足时细胞获得能量是通过氧化磷酸化，极少数缺氧情况细胞获得能量是通过糖酵解，但肿瘤细胞都是通过糖酵解来获得能量。
这种从正常细胞到肿瘤细胞的获取能量的方式切换，被称为代谢重编程，也被认为是细胞发生癌变最重要的特征之一。
NOX4可促使产生ROS，一般认为细胞中ROS的积累会导致细胞凋亡，而作者前期研究发现在肿瘤细胞内由NOX4介导产生的ROS不仅不会导致细胞的死亡还会促进肿瘤细胞的存活。
那NOX4介导的ROS过程是如何将两大临床现象（肿瘤耐药和肿瘤细胞代谢重编程）联系起来的？这正是本文关注的内容。
本研究发现NOX4定位于线粒体内膜中，线粒体中ATP在亚细胞水平上的重分配扮演变构开关的角色，活化NOX4。NOX4产生的ROS抑制PCAF依赖的乙酰化和PKM2的溶酶体降解。
结果总览
Fig.1-Fig.3是本文的第一部分内容，证实ATP可与NOX4结合并且一直NOX4的作用。ATP是能量代谢的重要产物，因此通过以上结果将NOX4与能量代谢建立联系。
图4则证明NOX4参与RCC肾癌的耐药现象。
图5和图6通过机制研究证实，NOX4通过调控PKM2影响RCC的耐药现象。
最后图7-图9分别在动物、临床样本、来源于临床样本的原代细胞中证实了能量代谢调控ATP，ATP调控NOX4，NOX4调控PKM2介导RCC耐药。
本研究虽然机制比较复杂，但是条理清晰，思维缜密，值得大家细细品读。
数据解构
为了研究NOX4分子的功能，首先作者对NOX家族序列进行分析，经过严密的生物信息学分析，发现在C末端有一个潜在的可能的 motif。
这个motif的位置从534-541氨基酸，该结构域是NOX4特有的，进一步分析发现七在不同物种之间也具有很好的保守性。
因此推测NOX4特有的结构域很可能介导了NOX4的某些特殊功能和作用，因为该NOX4特有的motif是ATP/GTP结合域。该结果也提示研究者下一步研究NOX4是否和ATP/GTP发生直接相关作用。
研究者克隆了NOX4的一段序列，制备NOX4突变载体后，进行NOX4与32P标记的ATP蛋白结合实验。结果证实，ATP蛋白加入剂量越大，与ATP结合的NOX4量也越大，二者呈现很好的剂量依赖关系。
在图d中是将未标记的ATP预先与NOX4充分孵育，再加入32P标记 的ATP，结果表明NOX4与未标记的ATP结合后，无法再与32P标记 的ATP结合。
图e则证实540位的赖氨酸对于NOX4与ATP结合是十分重要的，因为突变体NOX4与ATP完全没有结合。
除了体外结合实验，研究人员还采用了等离子共振技术研究ATP和NOX4的结合，将NOX4或者NOX4-MUT蛋白固定在生物芯片上，这时单个的NOX4有一个光谱，ATP和NOX4结合后，光谱发生迁移和变化。
该试验结果如下图所示，野生型的NOX4分子可以和ATP结合，光谱发生迁移和变化，而突变型的NOX4光谱变化不大。
以上实验通过体外结合实验和表面等离子体共振技术都证实ATP和NOX4相互结合。那么二者结合后的生物学功能是什么呢？
为了验证这一问题，研究人员加入了生理浓度的ATP，随着加入ATP浓度升高，超氧化物的浓度越来越低。说明ATP和NOX4结合后，NOX4产生更少的超氧化物。但是如何加入ADP或者GTP则没有这种效果。
图1主要证实NOX4可与ATP相互结合，该结合作用抑制NOX4产生超氧化物的能力。
接下来主要研究NOX4的亚细胞定位，作者的前期工作中已经证实了NOX4在RCC细胞内表达上调。因此本文选用RCC细胞为研究模型，采用共聚焦显微镜检测NOX4亚细胞定位。
发现NOX4与线粒体特异性染料MTR有共定位，提示NOX4主要定位在线粒体。除此之外，作者还采用RCC进行细胞分离，分别在线粒体组分和胞浆组分中检测NOX4，发现NOX4主要定位于线粒体。
由于线粒体含有双层膜解构，那么NOX4到底定位于线粒体外膜还是内膜呢？为了回答这一问题，研究者采用了蛋白酶体外水解实验。
蛋白酶K具有光谱水解蛋白的作用，位于线粒体外膜的蛋白先被水解，内膜的蛋白后被水解。在蛋白酶处理15min后，外膜蛋白VDAC就已经被水解，但是NOX4表达没有改变，因此NOX4定位于线粒体内膜。
NOX4可促进细胞内超氧化物的产生，那么ATP和NOX4结合后，是否影响NOX4产生超氧化物的能力？首先分离线粒体，之后加入ATP，发现加入ATP后线粒体内产生超氧化物的量显著降低。
为了进一步证实ATP介导的超氧化物形成能力降低是依赖于NOX4的，研究人员在提取的线粒体样本中进行免疫共沉淀实验，富集了含有NOX4的线粒体组分，在NOX4阳性的线粒体内加入APT，超氧化物形成显著受到抑制。
图3作者主要研究NOX4与能量代谢的关系。作者研究的细胞模型是RCC，该细胞模型中缺失VHL表达，氧气的消耗速率（OCR）比较低，产生的ATP数量很少，说明细胞的氧化磷酸化速率比较低。如果在RCC模型中过表达VHL，可显著提高细胞的氧化磷酸化水平。并且提升ATP数量。
其次在缺失VHL细胞内，无论是ROS还是超氧化物或者过氧化物都显著升高。但是过表达VHL后，三者都显著升高。
综上所述，氧化磷酸化水平升高，促进ATP产生进而抑制NOX4功能。
肾癌RCC细胞对药物诱导的凋亡是具有抵抗效应的。而NOX4敲减后，增强了药物诱导的凋亡现象。
在研究体系中加入线粒体超氧化物抑制剂（）中和线粒体内的超氧化物，结果细胞对药物的敏感度增加，增加凋亡比例。
基于图2的实验结果，可推测提升ATP含量，能抑制NOX4功能，促进药物诱导的凋亡。
为了验证这一假说，研究者采用两种方式提升ATP含量，第一种加入半乳糖，另外一种是过表达VHL。实验结果显示，提高ATP后，细胞凋亡比例升高。
而在图f，g，h中，突变NOX4关键540位氨基酸后，以上效应消失。
图5进入机制研究，研究NOX4的下游分子。作者通过文献回顾，发现丙酮酸激酶催化糖酵解的最后一步，而且丙酮酸激酶有两种亚型PKM1、PKM2；
文献显示PKM2异常表达在肿瘤细胞内非常常见，所以作者推测PKM2可能参与了RCC细胞耐药。并且通过敲减PKM2证实了以上推测，结果见下图。
在图d和图e，作者检测敲减NOX4后，PKM2和PKM1的表达，发现PKM2表达显著降低，而PKM1表达基本不变。
已经有文献报道PKM2可以发生乙酰化修饰，修饰后的PKM2可进入溶酶体降解途径。
因此作者在NOX4敲减的细胞内，检测PKM2乙酰化水平，发现其显著升高，初步证实NOX4敲减可提高PKM2乙酰化水平，乙酰化的PKM2进入溶酶体降解途径。
为了进一步证实该观点，加入溶酶体抑制剂3-MA后，即便敲减NOX4后，PKM2表达也不会降低。上述结果证实NOX4敲减可提高PKM2乙酰化水平，乙酰化的PKM2进入溶酶体降解途径，从而降低PKM2的表达水平。
进一步研究发现，NOX4敲减的细胞内，Etop诱导的凋亡明显升高，而加入3-MA后，凋亡比例下降。
目前已经直到PCAF和P300都可以介导PKM2的乙酰化，在NOX4敲减的细胞中再敲减PCAF和P300，只有敲减PCAF细胞内凋亡比例明显下降。
实验也证实敲减PCAF细胞内，PKM2表达明显升高，而敲减PKM2后，PKM2表达不变。
随后，作者构建了一个PKM2突变的载体，并且在敲减NOX4细胞内，过表达PKM2突变质粒，药物诱导产生的细胞凋亡被抑制。
在NOX4敲减细胞内，过表达突变体NOX4K(540A)，或者过表达VHl细胞中，PKM2表达量升高
由以上结果我们可以总结出以下调控关系。
在研究完整条通路后，作者分别在动物模型和临床样本中进行了验证。
首先发现，体内实验中抑制NOX4后，RCC细胞的药物敏感性增强。
此外还在临床样本中分离了线粒体组织样本，并检测NOX4和PKM2的表达，发现二者在肿瘤来源的样本中高表达。加入ATP后，超氧化物含量显著降低。
最后为了验证NOX4是否在人的RCC内参与介导耐药。研究人员从肾癌切除术中分离RCC肾癌细胞，并在原代培养的细胞内，敲减NOX4表达加入Dox孵育，发现NOX4敲减的细胞内，DOX诱导的调往现象显著升高。
并且原代细胞内NOX4和PKM2都呈现高表达，并且PKM1表达不变。
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