写在前面:在细胞培养工作中,常需要了解细胞状态和鉴别细胞死活,用于确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度,来进行下一步的实验操作,因此,就引入了我们今天要说的两种细胞计数染料:台盼蓝+AO/PI。
台盼蓝染色法
台盼蓝:蓝灰色粉末;溶于水,微溶于乙醇,不溶于其他有机溶剂;细胞活性染料,是组织和细胞培养中最常用的死细胞鉴定染色方法之一,常用于检测细胞膜的完整性,细胞是否存活。
台盼蓝
台盼蓝化学式
实验原理:正常的活细胞,胞膜结构完整,能够排斥台盼蓝,使之不能够进入胞内;而丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失,即可认为细胞已经死亡。因此,借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。
台盼蓝染色的K562结果图,蓝色为死细胞
常用染色浓度:一般成品试剂是0.4%的储存液,使用时需稀释10倍
台盼蓝染色的优点:价格低
台盼蓝染色的缺点:①PBMC分离过程中会有红细胞的残留,其大小与PBMC 接近,台盼蓝法不能分辨红细胞与活的PBMC,易造成浓度与活率的差异;②CHO 细胞在培养过程中会产生细胞碎片和杂质,台盼蓝法无法进行准确区分;
AO/PI染色法
AO/PI:是指吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)共同组成
吖啶橙(,简称AO):可以发出绿色荧光的DNA 结合染料
碘化丙啶(,简称PI):可以发出红色荧光的DNA 结合染料组成
染色原理:AO 可以通过完整的细胞膜,嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核,呈现绿色荧光;PI 只能通过不完整的细胞膜,即死细胞的细胞膜,嵌入所有死细胞的细胞核,呈现红色荧光。当两种染料均存在于细胞核内,在合适的AO、PI 配比下,两种染料发生能量共振转移,死细胞在绿色通道下(EX:525/30,EM:600LP)激发出红色荧光。
AO/PI染色的K562结果图,红色为死细胞
染色浓度:一般都是买的成品试剂
AO/PI染色的优点:①弥补了台盼蓝染色法的不足;②由于AO 和PI 为DNA结合染料,因此可有效排除杂质以及红细胞的干扰,确保对样品进行准确计数;
AO/PI染色的缺点:成品试剂的成本较台盼蓝高
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