功能性证据PS3/BS3 怎么使用(ClinGen 2020年)

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2015年，美国医学遗传学与基因组学学会(The of and , ACMG)发布的序列变异解读指南，对PS3 BS3 功能研究描述如下：

功能实验研究是一种研究变异致病性的非常强大的工具，然而并非所有的功能研究都能有效地预测基因或蛋白的功能。例如，一些酶学实验利用成熟完善的方法可以用来评估错义变异在代谢途径中对酶活性的影响(如α-半乳糖苷酶功能实验)；

而另一方面, 某些功能实验在评估变异对蛋白质功能的影响时缺乏一致性。评估一个功能检测方法是否有效时，必须考虑该功能实验在多大程度上反映了其发挥功能的生物环境。例如, 与体外表达蛋白相比, 直接在患者或动物模型的活检组织中进行酶的功能实验更有说服力。同样，可以反映蛋白质全部生物学功能(如酶分解底物功能)的实验则比仅反映一部分功能(如一种有附带结合能力的蛋白水解ATP的功能)的实验证据性更强。

功能实验的有效性、重复性、稳定性应重点考虑，这些参数用来评估功能实验的分析性能以及判定样本诊断信息的完整性，该完整性容易受标本采集的方法及时间、存储及运输的影响。CLIA(临床实验室改进修正案)认证实验室建立的检测方法或商品化试剂盒可减少这些因素对实验的影响。评估变异在剪接位点、编码序列、非翻译区以及更深的内含子区域的影响时，对变异在mRNA水平(如mRNA的稳定性、加工或翻译)进行评估，可以提供丰富的信息. 相关的技术方法包括对RNA和/或互补DNA衍生物进行直接分析，以及体外剪接分析。

PS3证据的描述：

体内、体外功能实验已明确会导致基因功能受损的变异。注：功能实验需要验证是有效的，且具有重复性与稳定性。

BS3证据的描述：

在体内外实验中确认对蛋白质功能和剪接没有影响的变异。

功能学研究为理解变异对于蛋白质功能的影响提供了强有力的见解，并有助于对临床意义未明的变异(VUS)进行重新分类，所以在不同变异的解读中使用准确的、一致性的功能实验证据显得非常重要。

然而，ACMG/AMP指南没有提供关于如何评估功能实验证据的详细指导，而且PS3/BS3证据使用的差异是导致不同临床实验室之间对于变异解读不一致的主要因素。

为了进一步规范变异解读，临床基因组资源()建立了变异解读工作组( ,SVI)和不同的变异解读专家组( ,VCEPs)，以对ACMG/AMP指南中每条证据标准进行优化。

到目前为止(当时发稿日)，6个不同疾病领域的VCEPs已经发布了相关建议，包括PS3/ BS3证据中可以使用哪些功能实验及使用标准。不同VCEPs批准的实验方法差异很大，包括剪接实验，动物模型、细胞模型、不同的体外系统。VCEPs批准的实验方法通常考虑了疾病的机制，大多数包括野生型对照，但是统计分析和纳入对照的标准不太一致。

不同的VCEPs在定义“已明确(well-)”的实验方面存在显著差异，如实验设计、重复、对照、验证等，这表明在评估功能学证据的质量和适用性上存在一些主观性，可能会对变异的致病性分类不一致。

在整个PS3/BS3证据的改进过程中，使用了来自VCEPs开发的规则规范和专家意见。在缺乏严格统计学分析的情况下，评估适用于某一特定检测方法的证据强度大小，以不同数量的之前分类过的变异作为对照，估算其理论的致病性几率(odds ，)。

将总体建模数据中的致病变异比例作为先验概率(P1)，将功能异常或功能正常组中的致病变异比例作为后验概率(P2)。

计算方法：

=[P2 ×(1−P1)]/[(1−P2)×P1]

然后根据计算所得的值选择相应级别的证据强度(支持，中等，强，非常强very ).

需要考虑的要点和一般性建议

生理背景

在测定中评估的遗传结构和背景是决定临床变异解读是否合适的重要考虑因素。在评估功能性实验的有效性时，应考虑所用的实验材料(如，患者来源的样本、模式生物、体内细胞或体外系统)。

当使用患者来源的样本时，功能分析时需要评估遗传和生理环境(顺式和反式的其他变异、表观遗传效应、细胞类型、实验条件等)。

对于常染色体隐性遗传病，致病机制通常是功能缺失机制，外显率和表现度可与总体蛋白质活性阈值有关，反映的是基因变异与潜在的基因产物组合产生的细胞/生化表型。在这种情况下，重要的是要将导致不同表型(重度和轻度疾病)的总体蛋白活性水平与致病或良性变异的功能实验结果区分开。如果已知一种变异为纯合子，并且可以在多个无关个体中检出，则可以更有信心地解读来自患者来源的功能实验证据。

建议1：患者来源的样本的功能实验证据最能反映机体表型。一般而言，在有已知致病变异或纯合变异的患者中，最好先满足PP4证据(特定表型)。

通常，模式生物用于揭示基因在疾病中的作用(如删除基因或人工突变，以重现表型作为遗传病因的证据)。但是成本和效率相关问题限制了其应用。此外，模式生物在多大程度上能反映了人体解剖/生理/遗传背景？或者为了满足功能实验证据标准，是否必须重现完整疾病表型？生物体的基因组可能含有同源基因(具有等效或相似的功能)，或者模式生物体可能缺乏人类表型的相关同源性，从而影响人为引入的遗传变异引起的相关表型的表现程度。

即使在给定的物种内，可测量的表型也可能因生物体的遗传背景而异(例如代偿性变异)，因此最好使用多个品系或品种进行研究，但这会进一步增加实验成本。因此，建议重点关注细胞和生化方面的体内或体外实验，这是实验室评估人类疾病相关的变异时常用的方法。

建议2：考虑到上述注意事项，从临床变异解读的角度来看，模式生物的功能证据评估应采用细致的方法。如果将模式生物数据用于变异解读，则应根据提供的总体数据的严谨性和可重复性调整证据强度。

分子结果

变异的性质和研究变异的环境可显著影响实验结果。在确定使用人工工程变异的检测方法的临床有效性时，必须仔细考虑变异对表达基因产物的影响。例如，在正常基因组背景下，技术引入的遗传变异也是使用内源性细胞转录和剪接机制，必须考虑脱靶效应( )。相反，cDNA构建体的瞬时表达(通常包含人工启动子和可能导致变异过表达的其他调控序列)应使用对照，以确保过表达不会掩盖变异的真实效应。无义变异和移码变异导致密码子在倒数第2外显子的3'端最多50个核苷酸之前提前终止，这些变异通过无义介导的降解机制(-,NMD)消除mRNA。因此，在NMD不活跃的cDNA或系统中研究这些变异可能不能反映内源性情况。同样，核苷酸替换或其他框内变异对剪接的影响也不能使用cDNA构建体进行评估。另一方面，人工构建的cDNA表达可能可以在蛋白质水平上反映框内缺失变异或单核苷酸替换变异的功能。

建议3：虽然最好在更自然的基因组背景下验证变异，但这不是确证实验的要求。相反，应该考虑该实验方法如何影响结果的解读，并在确定证据强度时考虑研究是否控制了这些局限性。

由于单个功能实验可能无法完全反映与疾病发病机制相关的所有基因或蛋白质功能，因此功能实验的“正常”结果可能只是反映在实验中未恰当地检测到特定变异的功能效应。因此，为了确定何时以及以何种强度应用BS3标准，必须了解功能实验在多大程度上反映变异对蛋白的表达或蛋白功能域的影响。

还应该注意，不影响蛋白质功能的错义或同义变异可能通过引入一个隐蔽的剪接位点而产生负面影响。在决定是否应用BS3以及应用何种强度时，应考虑到这些注意事项。

mRNA剪接是一个复杂的过程，临床变异解读可以同时考虑预测和实验功能证据。利用内源性基因组背景或分析开发的RNA剪接验证可用于确定变异对剪接完整性的影响。

例如，最后一个外显子的异常剪接可能导致功能仍然完整的截短蛋白。一般而言，异常剪接在mRNA和蛋白质阅读框方面可能产生异质性结果。异常剪接的转录本可能发生NMD，而其他异常转录本可能导致蛋白缩短或截短，并伴有或不伴功能后果。不同细胞类型中各种选择性剪接转录本的相对转录丰度也可能影响下游的病理生理过程。

由于RNA剪接验证不能直接反映蛋白质功能，因此需要额外的建议来确定剪接实验的适用性，以区分PS3/BS3与PVS1(功能缺失)。经典的±1,2剪接变异适用PVS1证据是基于预测的，变异对mRNA稳定性和蛋白阅读框的影响，而功能验证是证明存在异常剪接并确认功能丧失机制。

对于影响蛋白长度但预测不会导致功能丧失的变异，例如由于异常剪接或大的框内缺失导致框内外显子跳跃，蛋白长度的变化可以单独用PM4证据，而如果功能验证实验证实了变异对蛋白功能的影响，则也可以使用PS3/BS3。

术语

标准化结构化语言可以改善临床实验室、医师和患者之间的沟通和透明度。应使用统一的术语来描述蛋白质功能的实验室测定结果并记录功能证据。因此，功能验证的结果不应被归类为“致病性”或“良性”，因为这会影响其他证据的临床判定。此外，将验证结果描述为“有害的(/)”的术语可能会造成混淆，因为它们的含义在很大程度上与上下文相关，并且通常只适用于功能丧失的疾病机制。

例如，疾病机制是功能获得(gain-of-)的情况下，变异可能对生物体有害，但在功能实验中对蛋白质活性没有影响。建立标准化的语言来描述实验结果是防止已发表数据的错误解读和减少PS3/BS3应用方面实验室间不一致的重要步骤。

建议4：术语“功能正常”或“功能异常”应用于描述特定功能实验中的特定变异功能影响。正如等人所概述的那样，应该使用规范性术语来描述“功能异常”的影响(即功能完全丧失-of-、功能部分丧失 loss-of-，中间效应 ，亚效等位基因、功能获得性gain-of-、显性负性-)。对证据的最终评估应同时考虑实验中的功能效应和疾病机制。

亚效等位基因( )：表型效应在程度上次于野生型的突变基因。该突变导致基因功能部分丧失，通过(蛋白质、RNA)表达减少或功能表现降低而导致的基因功能降低，但不是完全丧失。与纯合子相比，在反式缺失等位基因中，亚效等位基因的表型更为严重。

CLIA实验室开发的实验

所有在临床实验室改进修正案( , CLIA)实验室进行的检测或使用市售试剂盒进行的检测都必须经过内部使用的分析验证。

建议5：执行功能验证分析的实体不应管理是否满足PS3/BS3标准或达到何种强度。这一确定应基于实验的验证，包括使用适当的实验室对照和临床验证对照。

实验对照和临床验证对照

良好的实验室操作规范对于功能验证证据在临床变异解读中的应用至关重要。每个实验都应包括内部对照，实验结果的动态范围(例如，野生型和无效效应测定的结果)。在某些情况下，可以将实验结果标准化为野生型值，通常应在与验证变异相同的条件下运行。

实施良好的实验通常使用技术重复，控制与方案或仪器相关的随机差异，以证明给定实验中结果的可重复性。类似地，生物重复(例如，不同的菌落，细胞，或动物)需要控制随机的生物变异，并证明同一实验的结果在不同实验之间的可重复性。生物重复对于理解种群内的变异更为重要，而技术重复可以减少实验误差。

值得注意的是，在对这些验证对照变异进行临床解读时，应使用独立于功能数据的证据，以达到致病性/可能致病性或良性/可能良性的解读。所需对照的数量取决于实验的动态范围和每次重复的差异；实验对照还应与疾病机制(如获得功能或丧失功能)和变异类型相关。

对于与不同机制的多种疾病相关的基因，如果疾病的机制不同，则对一种疾病进行验证的检测不一定适用于分析其他疾病的机制效应。

之前发表的许多实验没有已知的良性或已知的致病性变异作为对照，或者可能在同一实验中仅使用了少数变异作为对照。

在没有功能验证证据的情况下，任何被分类为可能良性/良性或可能致病/致病的变异均可作为确定证据强度的对照。

在同一类实验的多个实例中进行测试时，可以将每种变异的检测值绘制在一起，以便为正常、中间、异常设置阈值。

功能证据评估和应用的临时框架

SVI工作组建议评估人员采用一个四步流程来确定功能实验的适用性和证据强度：

(1)明确疾病机制；

(2)评估在该领域中使用的一般类型的功能实验方法的适用性；

(3)评估具体案例中功能实验的有效性；

(4)将证据应用于特定变异的解读。

ACMG/AMP指南认为，有完整的功能实验研究即可默认为“强”级别证据(PS3/BS3)。而SVI建议对功能验证实验的评估应从假设无证据开始，并随着临床验证证据的增加，使用不同强度水平的证据(支持、中等、强)。

1. 明确疾病机制

为了发挥功能实验在遗传变异解读中的作用，必须充分理解潜在的基因-疾病机制，以确定哪些功能实验是适用的。因为一些基因与不同的疾病相关，这取决于其不同的致病机制(例如，功能获得、功能丧失、显性负效应)。

描述基因相关疾病的致病机制的组成内容：

1）基因名称：HUGO基因命名委员会(Gene , HGNC) 基因名称

2）相关疾病

3）遗传模式

(a)常染色体显性遗传

(b)常染色体隐性性遗传

(c)线粒体遗传

(d)X连锁遗传

(e)未确定

4）疾病致病的分子机制

(a)功能丧失(loss of )

(b)功能获得(gain of )

(c)显性负效应( )

5）生物学通路

2.评估在该领域中使用的一般类型的功能实验方法的适用性

评估功能实验类型，如模型系统、实验方法、功能实验结果。应根据已定义的基因致病机制进行评估(例如，功能丧失、功能获得、特定通路输出)。评估模型系统的相对优势和弱点，动物、细胞和体外模型是否适用于特定疾病机制的研究。本步骤的目的是描述可以用于临床变异解释的适用的功能实验类型。需要注意的是，证据的强度不是由功能实验的类别决定的，而是由功能实验验证指标决定的。

对于正在制定特定基因指南的专家组，建议他们不要做出笼统的声明，避免限制有效或适用的功能实验类别，也不应限制基于功能实验的证据强度。

3.评估具体案例中功能实验的有效性

对于适用的一般类型的实验方法，解读人员下一步应该进行具体案例中功能实验的有效性评估。许多不同的实验室可能使用相同类型的功能实验产生功能证据，但考虑到使用的具体方法和验证水平的差异，在将数据用于临床解读之前，需要对每个功能实验重复性进行评估。使用足够数量的验证对照来计算阳性预测值或确定值，可以提供最可靠的功能实验证据。如果没有这种水平的功能验证，该功能实验的预测价值是有限的。

3.1 功能证据不应用于以下情况(除非功能实验的动态范围和功能正常、不确定性或功能异常结果的定义阈值已经非常明确)：

3.2 使用支持水平的的致病性()或良性()证据的场景:

对照和重复实验，≤10个验证对照；

实验方法已被广泛接受，以前已经被验证过，或曾作为具有明确性能特征的试剂盒，但是对照和重复未记录。

3.3 使用中等水平的的致病性()或良性()证据的场景

3.4通过严格的统计分析计算出的，则使用相应强度的致病性或良性证据。

不同的值，对应不同证据等级

4.将证据应用于特定变异的解读

一旦对某一功能实验方法的具体实例进行整体评估，则该功能实验方法对某一特定变异的实验结果可作为该变异解读的证据。

累积证据