唐红：一种有前途的新型HBV血清标志物——HBcrAg

▋ 陈恩强， 唐红

四川大学华西医院

随着对HBV血清标志物研究的不断深入，乙型肝炎核心相关抗原（HBcrAg）逐渐进入临床医师的视线，其在慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒疗效评价和临床转归预测中的价值也逐渐被大家所认可。目前研究发现，HBcrAg由HBV前C/C区编码的HBcAg、HBeAg与P22cr（22 kD precore protein）3种蛋白质组成（共享C基因编码的149个氨基酸序列），其中P22cr 是HBeAg 形成前的中间产物，包含从-28~150的氨基酸序列的一种前核心蛋白，包括未剪切的信号序列，但缺少C末端的精氨酸富集区域，常存在于空缺的、不含病毒核心的病毒颗粒中。

目前，临床对于血清HBcrAg的检测主要采用化学发光酶免疫分析法（CLEIA），且日本富士瑞必欧株式会社已经开发出可用于商业化检测的试剂盒。血清HBcrAg 的计量单位为U/ml，以大肠埃希菌表达的重组前体 HBeAg（pro-HBeAg）为标准，与前体 HBeAg 10 fg/ml相对应的HBcrAg的免疫反应被定义为1 U/ml。相对于以转录为媒介的扩增方法，CLEIA法检测血清HBcrAg具有更好的敏感性，且当把cut-off值设置为1.0×10^3 U/ml时，血清HBcrAg分析的特异性可以达到100%。事实上，CLEIA法检测血清HBcrAg的最低检测下限为4×10^2 U/ ml，相当于4 pg/ml的pro-HBeAg（一种包含HBeAg的-10~183 氨基酸的重组蛋白）免疫反应性。目前认为，即使CHB患者血清中存在抗-HBc和抗-HBe，或者由前C区突变引起血清转换使HBeAg呈阴性时，也不会影响CLEIA法检测HBcrAg的敏感性和准确性。

1 血清HBcrAg是反映肝内HBV cccDNA的较好替代指标

HBV造成的慢性感染可进展为肝硬化乃至肝细胞癌，对人类健康有巨大威胁。目前认为，HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的长期存在是导致CHB难以治愈和肝癌发生的关键因素，因此动态监测肝内cccDNA的水平变化对于了解患者病情变化和评估治疗效果具有十分重要的意义。由于肝组织内HBV cccDNA的检测需要做肝活组织检查，而肝活组织检查是一种有创检查，多数患者不愿意接受（特别是进行多次肝活组织检查），故通过肝活组织检查来监测患者肝组织中的HBV cccDNA水平在临床上还存在着较大的困难，目前迫切需要寻找一种操作方便且能反映肝组织内cccDNA水平的血清学替代检测指标。目前认为，患者外周血中HBcrAg、HBV RNA和HBsAg定量均可作为反映肝组织内cccDNA水平的血清学替代检测指标。

四川大学华西医院唐红教授团队曾分析139例接受肝活组织检查CHB患者血清中HBcrAg、HBsAg、HBV DNA和肝内cccDNA的水平，发现血清HBcrAg水平与肝内HBV cccDNA水平呈显著相关（r=0.929, P＜0.001），且这一相关性明显优于HBsAg（r=0.742, P＜0.001）和HBV DNA（r=0.854, P＜0.001）。进一步对32例接受恩替卡韦治疗的患者进行动态分析发现，肝内HBV cccDNA的减少与外周血HBsAg和HBcrAg下降相关，但相较于外周血HBsAg（r=0.572, P=0.001）、HBcrAg（r=0.665, P＜0.001）与HBV cccDNA下降幅度具有更好的相关性。据此认为，相较于血清HBsAg或HBV DNA水平，外周血HBcrAg水平与肝细胞内HBV cccDNA水平的正相关性更强。

唐红教授团队近期对CHB患者外周血HBcrAg、HBV RNA和HBsAg反映肝组织内HBV cccDNA水平的情况也进行了直接的比较。该项研究共纳入110例接受了肝穿刺活组织检查且未接受过任何抗病毒治疗的CHB患者，其中包括85例HBeAg阳性患者和25例HBeAg阴性患者。研究发现，在HBeAg阳性患者中，外周血HBcrAg水平与HBsAg和HBV RNA水平均呈正相关，且HBV RNA水平与HBsAg水平亦呈正相关；而在HBeAg阴性患者中，外周血HBcrAg、 HBsAg和 HBV RNA三者间无显著相关。多因素线性回归分析提示，外周血HBcrAg、HBsAg和HBV RNA在HBeAg阳性患者中均与肝内cccDNA水平显著相关；但在HBeAg阴性患者中，仅HBcrAg与肝内cccDNA水平显著相关。在HBeAg阳性患者中，尽管HBcrAg水平受肝组织炎症活动度和外周HBV DNA水平高低影响，但通过分层分析发现，在不同肝组织炎症活动度和外周HBV DNA水平条件下，外周血HBcrAg水平和肝内cccDNA水平均可以保持较好的相关性。

根据目前可获得文献资料，上述研究是基于中国大陆CHB患者开展的首个直接比较外周血HBcrAg、HBsAg和HBV RNA定量（三个最备受关注的血清学指标）与肝组织内的HBV cccDNA相关性的研究，结果首次提示了外周血HBcrAg水平较HBsAg定量和HBV RNA能更好地反映肝组织内的HBV cccDNA水平，且不受HBeAg状态影响。由此可见，在现有的条件下，通过检测外周血HBcrAg水平，可较准确反映肝内HBV cccDNA水平，这对临床客观评估现有抗病毒药物的疗效以及将来选择停药时机具有重要意义。

2 血清HBcrAg可预测自发或治疗引起的HBeAg血清学转换

HBeAg血清学转换是HBV感染获得免疫控制的结果，一旦发生HBeAg血清学转换，就预示着患者未来发生HCC的风险大大减少。在真实的临床世界中，部分机体免疫力强的患者，即使不通过抗病毒治疗也能自发的实现免疫控制，出现HBeAg血清学转换。但大部分患者还是需要通过抗病毒治疗才能实现HBeAg血清学转换。

唐红教授团队近期对31例接受PEG-IFN治疗的HBeAg阳性CHB患者进行为期6个月的随访研究发现，9例患者在停止IFNα治疗后的随访过程中出现HBeAg血清学转换。在发生HBeAg血清学转换的患者中，血清HBcrAg水平在PEG-IFNα治疗结束后的随访过程中仍表现出持续显著下降，而血清HBsAg水平则下降不明显；且受试者工作特征曲线分析表明，PEG-IFNα治疗第1个月时的血清HBcrAg绝对定量水平和相对于治疗前的下降幅度均可较好预测PEG-IFNα治疗停药随访6个月时的HBeAg血清学转换。结果提示，PEG-IFNα治疗早期的血清HBcrAg水平是预测PEG-IFNα治疗停药随访6个月时的HBeAg血清学转换。

我国吉林大学第一医院牛俊奇教授团队研究发现，血清HBcrAg可有效预测恩替卡韦或PEG-IFNα治疗的HBeAg阳性CHB患者的HBeAg血清学转换。

来自北京大学人民医院魏来教授团队的研究结果提示，检测血清HBcrAg水平有助于对CHB的自然病程进行监测，且HBcrAg水平的动力学变化可以准确预测CHB患者的自发性HBeAg血清学转换。

唐红教授团队研究发现，血清HBcrAg水平与HBV慢性感染的自然史分期有关。血清 HBcrAg 在免疫耐受期和免疫清除期处于最高水平，而在非活动携带期则处于最低水平，提示定量检测血清HBcrAg水平或将帮助确定HBV感染所处的自然史阶段。

Steo等于2014年报道的研究结果显示，HBeAg阳性慢性肝炎与HBeAg阳性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别为7.92和8.54 log U/ml, 而HBeAg阴性慢性肝炎与HBeAg阴性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别为4.92和2.6 log U/ml。

Maasoumy等于2015年报道的研究结果亦显示，HBeAg阳性慢性肝炎与HBeAg阳性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别为8.11和8.41 log U/ml, 而HBeAg阴性慢性肝炎与HBeAg阴性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别为4.82和2.00 log U/ml。

由此可见，血清HBcrAg不仅可显著区分HBeAg阳性和HBeAg阴性的慢性肝炎/慢性感染者，而且有助于区分HBeAg阴性慢性肝炎与HBeAg阴性慢性感染者。然而，目前关于HBV慢性感染自然史各分期的血清HBcrAg最佳截止值仍有待确定，未来期待有更多大样本、更长周期的前瞻性研究进一步探索。

3 血清HBcrAg可预测停药复发

HBsAg消失或血清学转换是目前CHB抗病毒治疗安全停药的公认标准，但达到此目标并不容易。所以在实际的临床诊疗过程中，对于部分HBsAg阳性的CHB患者，可能会因为各种原因而需要考虑停药。如何让患者停药后能够始终处于非活动性携带者状态是临床医师需要认真思考的问题。目前认为，决定CHB抗病毒停药后能否始终处于非活动性携带状态主要取决于两个关键因素，即残存于肝细胞中的HBV cccDNA复制能力和机体对HBV特异性免疫清除能力。

残存于肝细胞中的HBV cccDNA的复制能力受限于其水平、启动因素和复制环境等。在机体未受到特殊状况影响的前提下（即启动因素和复制环境相对稳定），肝细胞内HBV cccDNA水平是决定HBV cccDNA复制能力的关键因素。因此，了解肝组织内HBV cccDNA水平有助于临床医生判断何时停用抗病毒药物及预测停止治疗后HBV是否会重新复制活跃并导致乙型肝炎复发。

唐红教授团队前期研究发现，血清HBcrAg是反映肝内HBV cccDNA水平的较好替代指标，其准确性优于血清HBV RNA和HBsAg水平，因此目前认为血清HBcrAg可能是预测抗病毒治疗停药后是否复发的一个有效指标。

血清HBcrAg定量目前已被日本CHB指南推荐用于CHB患者核苷（酸）类似物停药后病情复发的风险评估。对于接受核苷（酸）类似物持续抗病毒治疗2年以上的患者，若停药时血清HBV DNA和HBeAg均阴性时，可通过病毒抗原（即HBcrAg和HBsAg）水平评分来评估停药后的复发风险。

在该评分系统中，根据停药时血清HBsAg水平高低，分别给予0分（＜80 IU/ml）、1分（80~800 IU/ml）和2分（≥800 IU/ml）；根据停药时血清HBcrAg水平高低，分别给予0分（＜3.0 log U/ml）、1分（3.0~4.0 log U/ml）和2分（≥4.0 log U/ml）。根据血清HBsAg和HBcrAg评分总和，可进一步将患者的停药后复发风险分成3个级别，即低风险组（总评分0分）、中等风险组（总评分1~2分）和高风险组（总评分3~4分）。低风险组预测停药成功的百分比为80%~90%，即患者可以考虑停药，但仍需要警惕复发（因为仍有少数低风险患者后期仍可出现肝炎复发）。中等风险组预测停药成功的百分比近50%，即患者根据病情可以考虑停药，但有必要做进一步考虑关于将来停药的条件和方式。高风险组预测停药成功的百分比仅为10%~20%，推荐继续治疗。

需要注意的是，血清HBsAg和HBcrAg间并不存在显著的相关性，对于血清HBsAg水平低于80 IU/ml的CHB患者，其血清HBcrAg水平可能仍处于较高水平；同样对于血清HBcrAg＜3 log U/ml的患者，其血清HBsAg水平可能仍处于较高水平。因此，仅根据血清HBsAg或血清HBcrAg水平来评估是否停药可能存在不足。

唐红教授团队通过对接受8年核苷（酸）类似物治疗的CHB患者外周血HBsAg和HBcrAg水平进行检测后发现，血清HBsAg和HBcrAg水平均随着抗病毒治疗时间的延长呈逐渐降低的趋势，在治疗第8年时，9.57%的患者实现了血清HBsAg＜100 IU/ml和21.3%的患者实现了血清 HBcrAg＜3 log U/ml。但进一步根据血清HBsAg和HBcrAg水平对患者停药复发风险进行评估时发现，低风险组仅3.2%，而中等风险组和高风险组患者却高达34.0%和62.8%。这一结果似乎可以解释为何临床上相当一部分血清HBsAg低水平甚至消失的CHB患者在停用抗病毒药物之后短期内即可出现肝炎复发，对于这部分患者若能够同时检测血清HBcrAg水平则或许有助于避免盲目乐观的停药决策。

4 血清HBcrAg可预测HCC发生及术后肿瘤复发

肝细胞的炎症刺激和HBV基因整合被认为是HCC发生的主要原因，而持续的cccDNA存在是HCC的高危因素。在HCC患者中，血清HBcrAg与肝内HBV cccDNA同样存在较高的相关性，故有学者推测CHB患者外周血持续高水平HBcrAg可能与HCC的发生发展有关。

为了解血清HBcrAg水平是否与HCC发病率存在相关性，Tada等对1031例未接受治疗的CHB患者进行了平均10.7年的随访，发现血清HBcrAg在预测HCC发生方面优于血清HBV DNA和HBeAg，且HBcrAg>2.9 log U/ml是HCC发生的独立预测因子［风险比=5.05，95%可信区间（95%CI）：2.40~10.63］。

Cheung等进一步通过对76 例接受核苷（酸）类似物治疗后均检测不到血清HBV DNA的CHB患者进行研究发现，与未发生HCC患者相比，HCC组治疗前HBcrAg水平更高（5.45 log U/ml vs 4.55 log U/ml, P=0.005）；且治疗前HBcrAg>4.67 log U/ml和治疗后HBcrAg>3.89 log U/ml均能独立预测HCC的发生。血清HBcrAg也被报道可用来预测HCC切除或射频消融后的复发。

Hosaka等对55例核苷（酸）类似物治疗期间发展为HCC并进行根治性切除术或经皮消融治疗的患者进行研究发现，血清HBcrAg>4.8 log U/ml时，2年内HCC复发的危险比为8.96（95％CI：1.94~41.4）。

此外，近期发表的多项研究亦提示，在核苷（酸）类似物治疗过程中，若CHB患者外周血HBcrAg持续处于高水平则更容易发展为HCC，而HBeAg血清转化后3年内的高HBcrAg水平与CHB患者的HCC发展独立相关。

由此可见，血清HBcrAg可预测HCC发生及术后肿瘤复发，因此在抗病毒治疗过程中，在追求病毒学应答的同时，有必要将血清HBcrAg作为抗病毒疗效的评价新指标，并尽可能将血清HBcrAg控制在最低水平以最大限度降低HCC的发生发展和术后HCC复发风险。

5 小结

血清HBcrAg是肝组织内HBV cccDNA较好的无创替代指标，其可能很快成为疾病监测、抗病毒疗效评价和预测停药复发和HCC发生发展的新标志物。但是作为一项新的指标，血清HBcrAg在我国临床常规使用之前仍需要进行更广泛的临床验证。