干货分享 | PCR知识分享
01
PCR 的基本原理
PCR是一种选择性体外快速扩增DNA片段的方法。在体外以类似于细胞内DNA的半保留复制过程，以拟扩增的模板DNA分子，与模板DNA互补的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4种dNTP及适合的缓冲体系组成的反应体系，经过重复地变性一退火一延伸三步，扩增新的目的DNA链，这个过程通过控制反应体系的温度来实现。
PCR包含下列三步反应：
1、变性(denaturation)
将反应体系混合物经加热至94℃左右，维持较短的时间，使双链DNA变成单链DNA，便于下一步引物的结合。
2、退火(annealing)
将反应体系温度下降到特定温度（一般是引物的Tm值以下)，引物与DNA模板以碱基互补的方式结合，形成模板-引物杂交双链。退火温度是保证引物与DNA模板互补结合的关键。由于引物结构简单，加之引物量远远大于模板DNA的数量，所以DNA模板单链之间的互补结合很少。
3、延伸(elongation)
将反应体系的温度上升到72℃左右并维持一段时间，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物为起始点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，从5'→3'方向延伸反应，合成新的DNA双链。
以上三步反应为一个循环，重复进行变性、退火、延伸这三步反应，如此反复循环可以使DNA以指数形式进行扩增。上述过程1.5小时左右完成，从而使所需的目的DNA片段扩增放大百万倍。
02
PCR反应液成分
PCR反应体系主要包含以下五种成分
1、模板（template)
模板即扩增用的DNA，可以是任何来源DNA(如基因组DNA、质粒DNA等)或RNA（如总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等），但必须符合两个条件：一是纯度必须较高，二是浓度不能太高以免抑制。
50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量如下表所示
2、引物（primers)
人工合成的一对引物可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序列，其中一条称为上游引物，另一条称为下游引物。引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
(1)引物设计
引物设计的基本原则：①引物长度。15~30bp，常用为20bp左右；②引物碱基。G C含量以40%~60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌岭或密啶核苷酸的成串排列；③引物内部不应出现互补序列；④引物的Tm值。实际复性温度选择低于Tm值3-5 ℃。适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。⑤引物的序列。3'端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。引物的5'端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。⑥引物的浓度。一般使用终浓度各0.5umol/L，减量可以减少引物二聚体的产生。
(2)引物设计软件
主要有Primer Premier5.0、Oligo6.0、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3
3 、底物(dNTP)
dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的缓冲液将其pH调节至7.0~7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。一般存储浓度为10mo/L，各成分以等当量配制，反应终浓度为20~200umol/L，如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配。
4、DNA聚合酶
PCR所用的酶主要有Taq和Pfu两种来源，分别来自两种不同的噬热菌。其中，Taq扩增效率高但易发生错配：Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以，实际使用时必须根据需要做不同的选择。目前使用最多的是Taq酶。该酶在92.5℃、95.0℃和97.5℃时，其半衰期分别为130分钟、40分钟和5~6分钟，可见该酶具有良好的热稳定性。Taq酶还具有良好的延伸效率，其生物学活性在75~80℃时最高，一般用72℃，每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸。
5、PCR缓冲液(PCR buffer)
缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四种有效成分：①缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；②一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；③二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；④辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构。
03
实用的PCR技术
1、巢式PCR：保证扩增特异性
巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。
实验步骤：
第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。
第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。
2、TouchdownPCR ：提高扩增特异性
降落PCR（touch down PCR）：指的是每一个（或n个）循环退火温度逐步降低1度，直到达到一个较低的退火温度，该温度称为：“touchdown'退火温度，然后在该温度下继续循环10个左右循环。退火温度的起始温度高于计算的Tm15度左右，在接下来的循环中，退火温度每个循环降低1－2度（一般为1度），直到低于Tm值5度。
该策略的目的在于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即特异行扩增的反应物之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异产物在此时已经有一个几何数的起始优势，在剩余的反应中，特异产物会竞争非特异产物，特异产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。该方法主要用于避免非特异性PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异性退火易发生时。
3、OverlapPCR：多片段体外连接
重叠PCR由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
引物设计：
第一个片段的下游引物反向互补，置于作为第二个片段上游引物的5'端’；第二个片段的上游引物反向互补，置于作为第一个片段下游引物的5'端’；以此类推。
编辑｜魏 萬
审核｜宋 问
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2022
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