文献解读|胃癌ceRNA的功能机制研究
竞争性内源RNA(competingendogenous RNA,ceRNA)是指编码RNA及非编码RNA相互作用的复杂网络系统，目前ceRNA在人疾病中的研究十分火热，对于研究非编码RNA无疑是一种捷径，但是由于ceRNA的预测相对已经比较简单，想要发表较高分的杂志，后期机制研究必须足够严谨和充分，下面解读的这篇文献在研究思路和实验方法上，可以说是一篇完整的研究ceRNA功能的文章。
研究背景胃癌（GC）是最常见的癌症之一，其中转移成为GC临床实践中一个重大的挑战，是GC死亡和复发的主要原因。目前已有很多关于转移的分子机制研究，但mRNA和非编码RNA（ncRNAs）之间潜在调控网络的作用还未被完全阐明。
研究方法6对胃癌组织和癌旁组织进行mRNAs、miRNAs和lncRNAs microarray分析。
研究结果1
CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的靶标
为了确定GC中mRNA和ncRNAs的调控网络，使用microarray 分析6对胃癌组织和癌旁组织中差异表达的mRNAs、miRNAs和lncRNAs。结果发现，235种miRNAs，4329种lncRNAs，以及3369种mRNAs在两种组织中差异表达。然后将microarray分析结果与差异表达的miRNAs的预测靶标取交集。
根据差异表达mRNAspathway富集分析结果及miRNAs和lncRNAsmicroarray分析结果，选择与癌症发展有关的经典通路中的经典基因进行ceRNA分析。
结果表明，Tight junction信号通路中, CLDN4和癌症发生密切相关。进而对CLDN4及相关的miRNA进行验证，表明miR-596和miR-3620-3p直接靶定CLDN4，负调控CLDN4的表达。
图1 GC中mRNA-lncRNA -miRNA调控网络
2
CLDN4体外生物学功能
为了验证CLDN4的生物学功能以及与miR-596和miR-3620-3p的关系，在三种胃癌细胞系中，SGC-7901、AGS和HGC-27，过表达CLDN4。
结果表明，过表达CLDN4显著上调GC细胞的增殖和侵袭能力，同时过表达miR-596或miR-3620-3p时可以消除这种影响。反之，在GC细胞系中敲降CLDN4时，细胞的增殖和侵袭能力受到抑制，同时抑制miR-596或miR-3620-3p的表达则恢复大部分影响。
同时，作者注意到过表达CLDN4诱导GC细胞出现间充质样形态特征，随后对CLDN4与EMT相关基因的相关性进行研究。结果显示，相较于pEX2-NC细胞系，在GC细胞系中过表达CLDN4能够诱导EMT。综合这些结果发现，CLDN4促进细胞增殖、侵袭以及EMT，同时miR-596和miR-3620-3p可消除部分影响。
图2CLDN4促进GC细胞增殖和侵袭
3
CLDN4和miRNAs在GC组织中的表达情况
对104对GC组织和癌旁组织中的CLDN4表达水平进行分析，结果显示，76.92%的患者在癌组织中显示更高的CLDN4表达水平，并且较高的CLDN4表达水平与总体存活率显著相关。多因素Cox分析结果显示较高的CLDN4表达是GC不良预后的独立预测因子。
同时，miR-596和miR-3620-3p在GC组织中表达水平显著降低。20例GC组织原位杂交结果显示，CLDN4、miR-596和miR-3620-3p主要在上皮和癌细胞中表达，主要定位于胞浆。
4
lncRNAs通过直接结合与miRNAs相互作用
研究发现，在“Tightjunction”网络中的14个候选lncRNA中，lncRNA-KRTAP5-AS1在过表达miR-596后下调最显著，过表达miR-3620-3p后，lncRNA-TUBB2A和lncRNA-KRTAP5-AS1表达降低程度最明显，并且过表达lncRNA-KRTAP5-AS1或lncRNA-TUBB2A上调CLDN4的表达。
构建GFP-MS2-lncRNA融合表达载体，利用GFP蛋白进行pull down,并对下拉产物进行检测，结果显示，lncRNA-KRTAP5-AS1RIP的产物显著富集miR-596和miR-3620-3p，同样，lncRNA-TUBB2A RIP产物显著富集miR-3620-3p。随后RNA pull down实验为miRNAs和lncRNAs之间的相关性提供了更确切的证据，miR-596和miR-3620-3p可被生物素标记的lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A拉下。
这些证据揭示了lncRNA-KRTAP5-AS1可以结合miR-596和miR-3620-3p，lncRNA-TUBB2A可以结合miR-3620-3p。
图3 lncRNAs通过直接结合与miRNAs相互作用
5
lncRNA作为ceRNA在体外调节细胞功能
基于Ago的RIP分析，可以通过免疫共沉淀富集到miRNA的结合靶标。在GC细胞系中分别过表达lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A，Ago抗体下拉的产物中，富集到的CLDN4转录产物显著下降，存在较少的CLDN4与miRNA结合，表明lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以与CLDN4竞争性结合miRNAs。
lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A作为ceRNA调节CLDN4的表达，促进GC细胞增殖、侵袭和EMT，lncRNA-KRTAP5-AS1充当miR-596和miR-3620-3p的ceRNA，lncRNA-TUBB2A充当miR-3620-3p的ceRNA。
图4 LncRNA-KRTAP5-AS1和LncRNA-TUBB2A充当ceRNAs
6
ncRNAs在体内调控CLDN4的功能
通过皮下移植的肿瘤模型和肿瘤转移模型检测不同细胞克隆对体内增殖和转移的影响，发现CLDN4促进体内增殖和转移，其可以被miR-596和miR-3620-3p所抑制，但能被过表达lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A所增强。
小 结1.通过构建胃癌ceRNA调控网络，寻找与胃癌发展密切相关的经典mRNA及其ceRNA。
2.确定目标分子-ceRNA后，在体内体外对调控机制及功能进行验证。
3.本文功能验证部分实验设计严谨且丰富，可以作为ceRNA后期验证的参考。
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