AP最前沿 | 急性胰腺炎的起始事件：胰腺腺泡细胞内胞吞囊泡的胞内破裂、胞吐及与肌动蛋白的相互作用

据Journal of Physiology 2018年4月报道 题：Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis作者：Michael Chvanov等。

背景

胰腺腺泡细胞通过胞吐作用分泌消化酶和消化酶前体（酶原）。酶原被装配在大的分泌细胞器内，在生理相关的促分泌剂缩胆囊素和乙酰胆碱诱导下由Ca2+信号级联介导胞吐作用。酶原的Ca2+依赖性分泌涉及复合胞吐作用，其中分泌颗粒不仅与质膜发生融合，而且彼此发生融合形成大的后胞吐结构，继而与质膜分离形成胞吞囊泡（EVs）。在生理状态下，胰酶颗粒的胞吐作用仅发生在细胞顶端区域，病理情况下也可以发生在基底侧。肌动蛋白丝可以和后胞吐结果相互作用，在调节胰腺腺泡细胞的胞吐作用钟起到重要作用。在胞吐作用后，腺泡细胞分泌的酶原通过胰管系统转运到十二指肠中，这种转运依赖于胰腺腺泡和胰腺导管细胞的液体分泌。生理情况下，酶原的活化特异性地发生在肠道内。然而在急性胰腺炎中，一些酶原在胰腺内被激活从而启动胰腺的自身消化，此过程的关键消化酶是胰蛋白酶。胰腺内胰蛋白酶原的激活时急性胰腺炎发展的早期事件，在临床和实验动物模型中都得到验证。胰蛋白酶原胰腺内活化的机制仍有争议，有很大一部分证据认为和组织蛋白酶B有关。胰腺腺泡细胞中胰蛋白酶原的激活是体外腺泡细胞损伤死亡以及体内模型胰腺组织损伤的重要原因。虽然胞内胰蛋白酶原的激活得到解释，但是启动细胞器的本源仍有争议。酶原激活需要囊泡ATP酶（V-ATPase）和酸性内细胞器环境。囊泡的形成是急性胰腺炎诱导剂触发腺泡细胞损伤的标志。我们最近研究了EVs内胰蛋白酶原的激活，这促使我们更进一步第研究这些细胞结构。

本研究最初的目的是描述在病理生理状态下EVs形成的动力学。然而，在项目的早期我们偶然发现三个新的现象：EVs的破裂、胞吐和肌动蛋白的相互作用。因此，这个项目重新聚焦于这些新细胞事件的描述。

材料和方法

从成年CD1小鼠（6-8周）中获得胰腺，制备细胞悬浮液与荧光探针共孵育。之后经CCK（10pM或10nM）诱导观察EVs和胰蛋白酶的活性。

结果

1.EVs的标记、形成和大小

图1

EVs快速形成可以被质膜不通透的荧光染料标记（荧光标记的葡聚糖）的胞内结构（图1）。小分子LY和diS-Cy5标记的囊泡数与分子量为3和10kDa的荧光葡聚糖标记的相似。分子量为40和70kDa的葡聚糖被部分排除在EVs之外提示融合孔的直径相对较小。在荧光标记的胰蛋白酶原中可以观察到类似的部分排除（图1A）。荧光探针LY，diS-Cy5和德克萨斯红标记的葡聚糖（TRD）产生类似的EVs标记，在本研究中用于检测和研究EVs的性质。

超大浓度的CCK（500pM和10nM）和毒性胆汁酸TLC-S（500μM）诱导剧烈的囊泡化（图1B）。超大浓度的CCK或TLC-S诱导的EVs的数量和大小显著大于CCK的生理浓度（10pM）诱导的或未被刺激的细胞（图1B和C）。值得注意的是，大于2.5μm的EVs仅在超大浓度的CCK或TLC-S处理的细胞中观察到（图1C）。

2.EVs的破裂和肌动蛋白相互作用

图1

D图白色箭头显示10nM CCK刺激后的细胞EV膜的破裂和内容物释放入胞浆。蓝色箭头提示胞质出泡，右侧的图显示经历破裂的EV和此过程中EV、细胞浆的荧光记录，黑色箭头表示如插图所示的时间点和荧光强度。

由于病理性刺激形成的大的EVs可以揭示这些细胞器的破裂。用超大剂量的CCK刺激细胞时，一些EVs在细胞内破裂使得探针从EVs逸出到胞质溶胶中并增加胞浆的荧光（n = 30）（图1D）。观察一次破裂事件所需的时间约8 h（480 min）。为了观察30个破裂，我们成像/分析了220个含有囊泡的细胞。EV的丢失可能是完全的（n = 17）（图1D）或部分（n = 13）（未展示）。在大多数实验中，质膜出泡和细胞死亡是发生在EV破裂之后（图1D），表明EV破裂具有细胞毒性。细胞死亡发生在破裂后的27±4分钟（n = 30）。我们选择直径大于2.5μm的液泡，在大的EV破裂期间可检测到胞浆荧光增加提示该事件为破裂。因此，通过超大剂量CCK或TLC-S刺激形成的大尺寸EVs是特别重要的。

图2

图2A：左侧为用10nM CCK刺激的腺泡细胞群，右侧所示区域由白色虚线限定的区域。胰蛋白酶原激活（即由于BZiPAR裂缝导致的荧光增加）以绿色显示。EV中的胰蛋白酶原激活在囊泡形成后开始。 囊泡内BZiPAR介导的荧光增加通常是短暂的，其荧光的下降在囊泡破裂之前（即在TRD下降之前）开始。可能的原因是BZiPAR裂解R110的最终产物是具有膜渗透性的探针，因此很难保留在细胞内。在实验结束时，我们观察到细胞胞质中TRD荧光的增加表明质膜完整性（即细胞死亡）的丧失。图2B：双胰腺腺泡细胞经苯甲脒（1mM）处理30min用10nM CCK刺激。白色箭头提示EV的破裂，右侧显示EV（红）和胞浆（黑）的荧光跟踪。白色虚线区域为感兴趣的特定区域。踪迹（1-3）与左图的数字相对应，代表时间点和相应的荧光强度。

EVs是胰腺腺泡细胞中胰蛋白酶原激活的位点。通过TRD（检测EVs）和BZiPAR（胰蛋白酶活性的荧光探针）的组合应用，我们观察到胰蛋白酶原激活发生在EV破裂之前（n = 13）（图2A）。值得注意的是，我们在胰蛋白酶抑制剂苯甲脒（n = 13）与CCK刺激的细胞共孵育中观察到囊泡的形成和破裂（图2B）。重要的是，使用的1mM苯甲脒能够消除胰腺腺泡细胞内可溶性胰蛋白酶原的激活。实验表明胰蛋白酶对EVs的破裂不是至关重要的。

图3

图3A：用10nM CCK刺激2小时后置于diS-Cy5和DTR，之后用标准细胞外液冲洗置于含FITCD的溶液中。FITCD图提示细胞的质膜是完整的。3B：同（A）刺激后的细胞仅在diS-Cy5存在下记录的代表性荧光发射光谱。通过595nm激光线激发荧光。该图显示记录的EV（绿色）荧光光谱，细胞的胞浆满足检测EV破裂/渗漏的标准（红色），胞浆不满足检测破裂/渗漏的标准（黑色）。插入的蓝色轨迹是从满足检测破裂/渗漏的标准的细胞胞浆荧光减去黑色迹线（主要为细胞自发荧光）产生的。3C：左图表示浸于含diS-Cy5指示剂的溶液中30分钟但没有刺激，只有极少的小囊泡形成。该图反映细胞胞浆荧光分布提示没有破裂的EVs。蓝线代表单个近似高斯的分布；右侧为细胞与diS-Cy5共孵育2小时后，10nM CCK刺激的频率直方图，两个近似高斯的峰如图所示。细质荧光高于阈值的细胞被定义为经历EVs的破裂/泄漏。3D显示囊泡破裂的细胞比例。用苯甲脒（1mM）抑制丝氨酸蛋白酶， CA074（10μM）和CA074-Me（1μM）（缩写为CA074 / Me）的组合对组织蛋白酶B的抑制不会产生显著的细胞比例差异对比对照组胞质荧光的增加。用100nM巴弗洛霉素A1（Baf）抑制V-ATP酶也没有在胞质荧光增加的细胞比例上存在统计学差异。

我们确实观察到一定比例的细胞具有完整的质膜，但细胞质荧光略有增加，其光谱特性与研究EVs（diS-Cy5或TRD）实验中使用的探针的光谱特性相对应（图3A和B），并且这种细胞的比例在CCK刺激后增加（图3C和D）。基于这些观察，我们推断细胞溶质荧光的增加是EV破裂或泄漏的结果。在实验中，抑制胰蛋白酶（1mM苯甲脒）和组织蛋白酶B（CA-074 / Me）都没有使diS-Cy5胞质荧光增加的细胞比例存在统计学差异（图3D）。抑制V-ATP酶是抑制细胞内/细胞器内酶原激活的的另一种机制，包括EVs内胰蛋白酶原的激活。在CCK刺激前30分钟用100nM BAF处理，不影响CCK刺激的细胞diS-Cy5细胞溶质荧光增加的比例（图3D）。这些结果支持胰蛋白酶和组织蛋白酶B可能不参与EV破裂的观点。

图4

在未经过胶原酶处理的小胰腺组织部分块中也观察到具有完整质膜的CCK刺激细胞中出现细胞溶质diS-Cy5荧光（图4）。因此现象不限于酶促分离的腺泡细胞或小的腺泡细胞簇。

图5

图5：第一列显示胰腺腺泡细胞的透射光图像，第二列显示（表达LifeAct）活腺泡细胞的肌动蛋白分布，第三列为和内吞diS-Cy5荧光相关的图像，第四列为合并图像，第五列为放大的独立囊泡。上排图像显示了EVs上完整F-肌动蛋白被膜。中间行显示一个大的囊泡，具有不对称的完整F-肌动蛋白被膜和很少或没有相关的肌动蛋白被膜的较小囊泡。底部的图像显示具有不完全F-肌动蛋白被膜的EVs和很少或没有相关F-肌动蛋白被膜的EVs。迹线显示荧光强度分布的实例反映了肌动蛋白（LifeAct染色，黑色迹线）和内吞diS-Cy5（绿色迹线）的相对位置。沿着图像上指示的箭头测量荧光强度。

图6

图6A：第二列SirActin显示肌动蛋白分布，第三列显示肌动蛋白与固定在胰腺腺泡细胞中的内吞探针的相互关系。第四列为合并图像。第五列放大的单个囊泡。上排图像显示披被F-肌动蛋白的EV。下排图像为没有相关的F-肌动蛋白被膜的EV。6B：肌动蛋白被膜明显的不均匀性和开窗。图像序列类似于（6A）描述的序列。。第五栏放大说明肌动蛋白被膜和合并图像。黄色箭头显示肌动蛋白被膜的明显开窗，而白色箭头表示密度增加。6C：用1μM的Jasp处理腺泡细胞导致CCK刺激的细胞中胞质的diS-Cy5显著减少（P = 0.03）。

图7

图7：肌动蛋白的染色和EVs的破裂。用10nM CCK刺激细胞，内吞的diS-Cy5以绿色显示。上部分图片显示两个EV的破裂，LifeAct染色为白色。下部分的图像显示包含两个大囊泡破裂的碎片（对应于上部分通道的前三个图像）。黄色箭头表示荧光探针通过肌动蛋白被膜中的开窗孔逃逸（上方囊泡）。最底层为合并图像，肌动蛋白以洋红色显示。该图显示两个囊泡在破裂之前的形状变化，但是这些变化在未被肌动蛋白包被的下方囊泡中特别突出。

尽管有一些EV是容易破裂，但是其他的EV是稳定的并且可以保持荧光探针数小时。囊泡的这种异质性表明腺泡细胞内含有保护一部分囊泡的稳定因子并且这种因子的丧失可能是囊泡脆性和破裂的潜在机制。考虑到F-肌动蛋白在酶原颗粒复合胞吐作用中的突出作用，我们将其列为这一作用的关键。

我们在胰腺腺泡细胞中表达LifeAct（一种F-actin标志物），在EVs上观察到肌动蛋白被膜。在10nM CCK刺激的细胞中，约28％的EV是有肌动蛋白被膜的（n = 89）（图5）。在大约三分之一的囊泡中，肌动蛋白被膜是不完全或有孔的（图5）。重要的是，很大比例的EV没有肌动蛋白被膜（72％，n = 89）（图4）。SiR-肌动蛋白（用于肌动蛋白的膜渗透性荧光探针）染色显示肌动蛋白包被的EV（37％的EV，n = 119）（图6A，上部）和未包被的EV（63％的EV，n = 119）（图6A，下部）。尽管这两种肌动蛋白染色方法都显示出类似的现象，但没有被膜的EV比例对于SiR-肌动蛋白来说略小。与LifeAct染色类似，SiR-肌动蛋白染色也显示EV上肌动蛋白被膜的不均匀性和开窗（图6B）。我们接下来利用肌动蛋白修饰化合物latrunculin-B和jasplakinolide研究肌动蛋白在EVs破裂（或阻止破裂）中的作用。Latrunculin-B（10μM）对CCK诱导diS-Cy5荧光升高的细胞比例增加没有影响（对照组和latrunculin-B处理组均为12个细胞制剂）。

相对低浓度（1μM）jasplakinolide的使用没有改变每个细胞的EV数（对照组中n = 112个细胞，jasplakinolide处理组中n = 103个细胞）。对照组（1.81±0.07μm，n = 223个液泡）和jasplakinolide处理组（1.89±0.07μm，n = 239个空泡组）之间的囊泡大小没有统计学差异（P = 0.41）。然而，用1μM的jasplakinolide孵育导致胞质diS-Cy5荧光增强的细胞比例中度但有统计学差异的（P = 0.03）降低（图6C）。 Jasplakinolide是一种稳定肌动蛋白的药物（Bubb等，1994），我们的研究结果表明，EV周围的肌动蛋白可能在增强这些细胞器，防止其破裂或渗漏方面发挥作用。这种观点得到图7囊泡通过肌动蛋白涂层中的狭窄开窗破裂的支持。

3.EVs的胞吐作用

图8

图8A：经CCK刺激的腺泡细胞基底侧质膜填充LY的EV发生融合（绿色，箭头表示融合的EV）。细胞外培养基含有TRD（红色），融合的特征在于探针的混入（黄色）。融合后，EV失去LY并获得TRD。底部的图像显示包含融合EV的区域。该图显示EV中记录的两种染料荧光的时间过程（由虚线突出显示）。8B显示在CCK刺激的细胞的顶端区域LY填充的EV（绿色）与TRD填充的（红色）后胞吐结构。底部的图像显示包含融合的EV（白色箭头）的区域。融合后，复合结构含有两种探针（黄色）。

在对EVs破裂的研究中，我们偶然发现了另一种允许胰蛋白酶逃离EV的限制的机制。这种机制涉及EVs的胞吐作用。为了系统地研究EV与质膜的融合能力，我们利用两种细胞不可渗透的染料中的连续孵育细胞：LY和TRD。这些实验的基本原理是通过EV和细胞外溶液之间的荧光分子的交换明确地识别融合事件。细胞在超大浓度CCK存在的情况下与LY孵育30分钟形成LY填充的EVs。然后洗涤细胞并在TRD存在的情况下再次超大浓度CCK刺激，形成了许多充满TRD的新EVs（图8A）。在细胞基底区域发现的一些LY填充的EV能够与细胞外溶液进行荧光探针交换（表现为LY的缺失和TRD的摄取），证实质膜基底部分的融合（n = 11）（图8A）。与记录EV的破裂的情况一样，EV融合的直接成像是耗时的。需要大约an15.3小时（920分钟）的共焦观察时间来完成单个融合事件。除基底侧融合事件外，一些LY填充的EV与细胞顶端部分充满TRD的胞吐后结构融合，表明EVs在该区域可能发生二次胞吐作用（n = 7）（图8B）。

结论

胰腺腺泡细胞利用复合胞吐作用分泌酶原。分泌（酶原）颗粒的异常复合胞吐作用导致巨大EVs的形成。比较分泌颗粒和EVs的大小，我们推断数十个甚至数百个分泌颗粒首先必须形成一个后胞吐Ω形结构，随后这种结构必须与质膜分离从而形成在TLC-S或超大剂量CCK刺激下的腺泡细胞中观察到大的EVs（直径高达12μm）。在EV中可能观察到的胰蛋白酶原激活，是因为并非所有酶原都通过融合孔从后胞吐结构释放。

EV包含潜在的破坏性消化酶（特别是胰蛋白酶）应该是无害的，直到它们逃逸到细胞溶胶或细胞外溶液中。我们利用分离的腺泡细胞和细胞簇发现大约40-50％的细胞至少有一个大的囊泡（图1C）。考虑到囊泡破裂大约每8小时破裂一次，我们可以假设在诱导急性胰腺炎的动物模型所需的时间内（雨蛙素模型12-24小时），大约20-30％的细胞经历EV的破裂。假设急性胰腺炎诱导的小鼠胰腺中细胞空泡化和空泡破裂的比例相似，可以推断腺体中很大比例的腺泡细胞（可能是20-30％的细胞）可能被液泡破裂引发过程破坏。

研究结果提示囊泡内胰蛋白酶原激活和组织蛋白酶B活性不是EVs破裂的关键。我们观察EVs长距离的移动和形状的大幅度的改变。这些移动和形状改变可能影响EVs囊泡与细胞骨架元素或细胞器在动态、拥挤的腺泡细胞内部的相互作用。我们认为这种相互作用产生的力量可能导致EVs的破裂。在本研究中，我们发现并描述了EV的F-肌动蛋白被膜。这种与肌动蛋白间相互作用的行为可能有助于保护EVs免于破裂。因此，肌动蛋白被膜的丢失会导致大的EVs的脆性和不稳定。

本研究描述急性胰腺炎诱导剂触发途径中的重要步骤。它遵循异常的Ca2+依赖性复合内吞作用和大EVs的形成。它还涉及EVs的破裂和它们与质膜的融合，包括介导胰蛋白酶释放到细胞内和细胞外环境中的过程。

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翻译：林佳佳

校对：叶 博