溶瘤病毒特性简介、临床生产及质量控制

溶瘤病毒免疫治疗是一种使用可在肿瘤细胞内选择性复制的天然或基因修饰病毒治疗癌症的方法。病毒杀死癌细胞的能力早已被承认，但在过去十年，才有临床试验证实其在肿瘤患者治疗中的应用优势。随着对病毒生物学、肿瘤免疫学以及分子生物学了解的深入，对溶瘤病毒的兴趣也在不断增加。

在近100万种脊椎动物病毒中，大约320,000种被认为可感染哺乳动物细胞。此类病毒有几个共同的特性，包括由单链或双链DNA或RNA组成的遗传元件，感染宿主细胞并在允许条件下进行复制的能力。

几种主要DNA溶瘤病毒的特性（Howard L. et al.,2015）。

几种主要RNA溶瘤病毒的特性（Howard L. et al., 2015）。

病毒感染的结果可能是高度可变的，这取决于病毒性编码基因的病原特性、病毒与宿主免疫系统之间的相互作用以及感染后病毒复制和/或诱导潜伏期的能力。对病毒进入、复制、诱导和/或对免疫反应的抑制以及裂解或潜伏感染的了解，引起了科研人员利用病毒进行人体疾病治疗的兴趣，且已有多个溶瘤病毒载体被选择用于治疗特定类型的肿瘤。相比标准的基于病毒的“疫苗”，溶瘤病毒可在“原位”直接感染并裂解肿瘤细胞。溶瘤病毒也可提供额外的“警报”信号，促进有效的抗肿瘤免疫反应。

溶瘤病毒进入肿瘤细胞的机制。溶瘤病毒利用不同的机制进入宿主细胞，包括肿瘤细胞通常过表达的细胞表面受体。一些病毒可通过多种受体，而一些受体可促进多种类型的病毒进入。一些病毒通过膜融合和合胞体形成的内吞作用进入细胞。一些病毒已知可优先靶向肿瘤细胞，但用于进入细胞的细胞表面受体尚未确定（Howard L. et al., 2015）。

溶瘤病毒不仅可诱导肿瘤裂解，还可诱导抗肿瘤免疫反应（T Yamaguchi, et al., 2018）。

虽然溶瘤病毒介导抗肿瘤活性的作用机制尚未被完全了解，但一般认为有两种主要的途径：在肿瘤细胞内的选择性复制，形成对肿瘤细胞直接的溶解作用；以及诱导系统性的抗肿瘤免疫。两种机制的相对贡献可能因肿瘤细胞类型和性质、病毒载体的特性、病毒间的相互作用、肿瘤微环境以及宿主免疫系统的不同而有差异。

特定的病毒可进入肿瘤细胞，并在细胞内选择性复制。尽管溶瘤病毒可进入正常和肿瘤细胞，但肿瘤细胞对应激、细胞信号以及稳态响应的异常性为病毒复制提供了“选择性”的条件。负责病毒检测和清除的正常宿主细胞抗病毒机制在肿瘤细胞中也可能处于异常状态。比如，蛋白激酶R（PKR）是帮助清除细胞内病毒感染的关键因子，但在某些肿瘤细胞中，PKR可能会缺失，增加了病毒复制，而在另一些肿瘤细胞中可能有活性，如低级别的肿瘤，这种差异会影响溶瘤病毒的治疗活性。

对溶瘤病毒的免疫反应是抗肿瘤作用的重要组成部分，但它也是一把双刃剑。一方面，在病毒感染背景下，通过允许肿瘤抗原递呈，病毒可帮助提高针对肿瘤细胞的免疫反应。而另一方面，中和性抗病毒反应可能阻断病毒复制和肿瘤细胞的持续感染。治疗结果取决这些对立力量间的复杂角力。但是，当系统性免疫完全参与后，治疗性反应可能同时发生在局部注射的肿瘤以及远处部位未感染的肿瘤。

多种病毒被提出可作为载体用于溶瘤病毒免疫治疗，也有很多工作通过衰减病毒致病性并提供免疫源性，对病毒载体进行优化。目前，腺病毒、痘病毒、HSV-1、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒（NDV）、呼肠孤病毒等都已进入了早期临床试验。国外，Amgen的T-VEC（基因修饰的1型单纯疱疹病毒，用于治疗晚期黑色素瘤）是FDA批准的第一个溶瘤病毒产品，而国内上海三维生物的溶瘤性腺病毒产品安柯瑞也已于2006年上市。

中国溶瘤病毒临床试验（D.Wei, et al., 2017）。

溶瘤病毒项目进入临床需经历的主要阶段，从新型溶瘤病毒药物治疗效率概念验证的临床前研究开始，锁定知识产权（提交专利文件）是成功寻求资金所必需的，特别是考虑到在GMP条件下进行生成的所需的高昂成本以及随之而来的挑战，必需有合适的工业化合作伙伴。使用合适的动物模型以进行物理学和毒理学研究，以证实溶瘤病毒的安全性是想监管机构递交研究型新药（IND）申请的前提，其需包括临床级溶瘤病毒生产和检测的所有信息。（G.Underecht, et al., 2016）

溶瘤病毒的生产策略

不同溶瘤病毒的不同特点，如病毒粒径、有/无囊膜等，要求生产策略必须针对各个病毒分别开发，而无血清培养条件的优化、病毒产量的提高、可放大纯化策略的开发以及可保证长期稳定性的制剂方法等在其它生物制品中的挑战，也适用于溶瘤病毒。临床级溶瘤病毒的制备大致可分为生产、纯化以及鉴定三个阶段，不同病毒所选择的生产细胞、培养条件、下游纯化方法以及检测技术的建立都有显著差别。以下为文献报导的几种溶瘤病毒的制备流程。

溶瘤性麻疹病毒生产流程图（考虑到病毒粒径100-200nm，需采用全程无菌工艺）（Kirsten K. Langfield，et al., 2011）

水泡性口炎病毒生产流程图（L.J.Ausubel,et al., 2011）

重组新城疫病毒（rNDV）生产流程图（L.A.Santry, et al., 2017）

监管和商业化问题

溶瘤病毒的活性复制特性对监管和生产形成了独特的挑战。大多数病毒在组织培养中增殖，且要求高滴度病毒生产、外源性病原体检测以及评估病毒纯度和复制潜力的方法。所以，必须考虑生产和灌装过程中的实验室安全问题、产品验证和纯度以及细胞培养获得的生物制品的质量设计。对于某些病毒，很难获得临床剂量所需的极高滴度裂解液，这就对生物技术生产提出了相比传统生物制品更大的挑战。

临床级AAV基因治疗载体特性质量控制检测策略的示例。载体使用经认证的原材料、成分和试剂，通过良好确定的生产工艺生产，以始终一致地达到最佳的载体产物纯度、效价和安全性。对生产过程中的每一步进行质量控制检测，包括所有产物中间体的工艺评估以及在关键步骤的额外检测，后者包括粗细胞收获液、载体原液以及终产物。此处所示的载体鉴定检测策略中，对载体原液和终产物阶段需进行多个QC检测项目。（J.F.Wright, et al., 2011）。

对此，FDA发布了一份指导文件草案，”Guidance for Industry: Design and Analysis of Shedding Studies for Virus or Bacteria-Based Gene Therapy and Oncolytic Products”为溶瘤病毒生产中使用的所有物料和细胞的质量控制检测提供了指导。。其它相关的文件包括“EuropeanDirectorate for the Quality of Medicines including Cell substrates for theproduction of vac­cines for human use”，“Tests for extraneous agents in viral vaccinesfor human use”。此外，还需对中间体和病毒批次进行污染物和效价检测。但是，相比重组蛋白，去除溶瘤病毒中的污染物，特别是微生物或病毒性污染物，更加困难，因为用于去除这些污染物的方法，也有可能作用于溶瘤病毒。溶瘤病毒制剂的质量也可在细胞中检测，并结合使用病毒特异性中和抗体，以确认作用是由病毒所介导。

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本文参考以下文献，文中图、表中内容为小编翻译，因水平有限，如有不当之处，敬请谅解。

参考文献：

1. D.Wei, J.Xu, X.Liu, et al., Fighting Cancer with Viuruses:Oncolytic Virus Therapy in China.Human Gene Therapy, 2017, DOI: 10.1089/hum.2017.212

2. G.Underechts,S.Bossow, B.Leuchs, et al., Moving oncolytic viruses into the clinic:clinical-grade production purifcationand characterization of diverse oncolytic viruses.MolecularTherapy — Methods & Clinical Development, 2016, 3:16018;doi:10.1038/mtm.2016.18

3. H.L.Kaufman,F.J.Kohlhapp, A.Zloza, Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs. CANCER IMMUNOTHERAPY, 2015, 14:642-662.

4. J.F.Wright,O.Zelenaia, Vector Characterization Methods for Quality Control Testing ofRecombinant Adeno-Associated Viruses.Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology,vol. 737, DOI 10.1007/978-1-61779-095-9_11

5. K.K.Langfield, H.J.Walker, L.C.Gregory, Manufacture of Measles Virus. Viral Vector for GeneTherapy methods and protocols,2011.

6. L.A.Santry. T.M.McAusland, L.Susta, et al., Production and Purification of High-Titer Newcastle Disease Virus for Use in Preclinical Mouse Models ofCancer. Molecular Therapy:Methods & Clinical Development, 2017, 9:181-191.

7. L.J.Ausubel, M.Maeseck, I.Derecho, et al., Current Good Manufacturing Practice Production of an Oncolytic Recombinant Vesicular Stomatitis Viral Vector for Cancer Treatment. HUMAN GENE THERAPY, 2011, 22:489–497.

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